氧化型低密度脂蛋白诱导U937细胞LOX|1的表达及卡托普利的干预

作者:齐艳红,郑杨,曾炜炜

作者单位：1温州医学院第二附属医院，浙江 温州 325000；2吉林大学第一临床医院心内科           【摘要】  目的：探讨应用氧化型低密度脂蛋白（Ox|LDL）培养的单核巨噬系细胞株U937细胞表面氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX|1）表达的情况，并进一步探讨卡托普利对其表达的影响。方法：应用酶联免疫吸附法（ ELISA）和 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞表面 LOX|1的表达。结果：细胞在Ox|LDL培养后LOX|1的表达明显增加（P<005），并且随着作用时间的延长和浓度的增加，其表达呈先递增后递减变化，在浓度为100 μg/ml，时间为24 h时达高峰（0965±0413），应用LOX|1阻断剂 PIA、角叉菜胶和卡托普利干预后其表达明显减少（P<005），结果分别为（0083±0024），（0075±0019），（0084±0025）。结论：Ox|LDL可诱导U937细胞表面LOX|1蛋白质的表达，卡托普利可通过抑制LOX|1的表达，从而抑制Ox|LDL对U937细胞的损伤，起到抗动脉粥样硬化的作用。

【关键词】  脂蛋白类 LDL 受体 LDL 卡托普利

    Study on the expression of LOX|1 on U937 cells induced by oxidized LDL and the protection of captopril/QI Yan|hong，ZHENG Yang，ZENG Wei|wei//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（1）:21

    Abstract：Objective:To investigate the expression of LOX|1 on U937 cells after incubating with Ox|LDL and the protective effect of captorilMethods:U937 cells were incubated and treated with different concentrations (0 to 300μg/ml) of Ox|LDL for 24 hours,and with 100ug/ml Ox|LDL for different time (0 to 72h)The protein expression of LOX|1 was determined by cell ELISA and Western Blot.Results:After incubation of U937 cell with Ox|LDL,the protein expression of LOX|1 increased(P<005).Pretreated U937 cells with captoril or PIA,the expression of LOX|1 decreased(P<005).Conclusion:Ox|LDL can induce the expression of LOX|1 on U937 cells,and captopril can protect cells through making the decreasing the protein expression of LOX|1.

    Author′s　address：Department of Cardiology,the First Hospital,Jilin University,Changchun,Jilin,130021,China

    Key words：Lipoprotein,LDL;Recipient,LDL;Captopril 已有大量的研究证实氧化型低密度脂蛋白（Ox|LDL）在动脉粥样硬化的形成和发展中扮演重要角色，而血管细胞通过受体介导的方式可中和降解之。1997年Sawamura等[1]证明这一功能受体为血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体（LOX|1），主要存在于内皮细胞的表面，它可以中和降解Ox|LDL，进一步引发斑块内细胞凋亡、基质的降解和炎症反应等，进而导致急性冠脉综合症（ACS）的形成。研究表明LOX|1在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表面都有表达[2]。本实验在国内首次探讨在Ox|LDL的诱导下LOX|1在单核／巨噬细胞系U937细胞的表达情况。

    1 资料与方法

    11 一般资料（1）实验仪器： 二氧化碳孵箱（RKI，日本），倒置显微镜（物镜10×或 20×，目镜 10×）（Hund D-6330 Wetzlar 21，德国），超净工作台（SW－CT－EFD，苏州），恒温水浴箱（H2S－H，哈尔滨），低温台式离心机（AERMLE2383K，德国）；（2）实验试剂：人髓系白血病细胞U937细胞由吉林大学基础免疫教研室馈赠，低密度脂蛋白（LDL）和氧化型低密度脂蛋白（Ox|LDL）购自北京协和基础研究所。IMDM培养基 （pH72，100IU／ml青霉素、100 μg/ml链霉素，由美国Sigma化学公司提供），10％胎牛血清，D-Hank’s液，其他试剂为国产分析纯，LOX|1 山羊抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司。LOX|1拮抗剂聚肌苷酸（Polyinosinic acid，PIA），角叉菜胶购自 Sigma公司。其它二抗和显色剂购自鼎国公司。卡托普利纯品（中美上海施贵宝公司馈赠）。

    12 实验方法

    121 细胞培养及实验分组：（1）细胞培养：用IMDM培养液（pH72、100IU／ml青霉素、100μg/ml链霉素）和10％胎牛血清。分别用培养瓶和培养板常规方法培养U937细胞，2~3 d传代，待细胞传至需要数量时即可用于实验；（2）实验分组：实验共分6组：①对照组：细胞置 IMDM培养基中于 5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养；②LDL组：在培养瓶中加入LDL 50 μg/ml，在IMDM培养基中于5％CO2、37℃、饱和湿度培养箱中培养24 h；③Ox|LDL组：在细胞的培养瓶中分别加入不同浓度Ox|LDL（50、100、200、300 μg／ml），在IMDM培养基中于5％CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养24 h。不同时间：在细胞的培养瓶中加入Ox|LDL 100μg／ml，在IMDM培养基中于5％CO2、3℃、饱和湿度培养箱中培养0、12、24、48、72 h；④PIA组：以 PIA（250 μg／ml）与细胞共同作用 1 h后，加入Ox|LDL（100μg／ml）共同作用 24 h；⑤角叉菜胶组：以角叉菜胶（250μg／ml）与细胞共同作用 1 h后，加入Ox|LDL（100μg／ml）共同作用24 h；⑥卡托普利＋Ox|LDL组，以卡托普利（10-5 mol/L）预处理细胞24h后，加入Ox|LDL（100 μg／ml），共同作用 24 h。

    122 细胞酶联免疫吸附法（ELISA）分析LOX|1蛋白质含量：细胞培养后弃去上清液，离心，洗板后用025％戊二醛固定20 min，用脱脂奶粉封闭过夜，加入1∶100驴抗人LOX|1多克隆抗体，于37℃作用2 h，洗板后加入1∶200生物素化山羊抗驴IgG，37℃作用 1 h，加酶底物室温 1 h洗板，TMB室温5min显色。以2mol/L 硫酸（H2SO4）终止反应，450nm酶标仪读A值。结果以波长450 nm处读值为A值，表示细胞LOX|1蛋白质表达水平。每个观察值设3个复孔，实验重复2次。

    123 Western Blot检测LOX|1的表达：细胞经冷PBS液冲洗3遍，用加样缓冲液裂解细胞，100℃水浴10 min后离心（10000 g×10 min），收集上清液，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，制备好的蛋白样品置-80℃冰箱保存备用。以20 μg蛋白／泳道上样，经12％聚丙烯酸胺SDA-PAGE电泳后，电转膜至醋酸纤维膜。室温封闭3 h，加一抗，室温下孵育2 h，再加生物素化山羊抗驴IgG，37℃作用1 h后，加酶底物室温显色，待蛋白显色清晰时，中止反应，拍摄照片，记录试验结果。

13 统计学处理各种计量数据均以均数±标准差(±s)表示，统计学分析应用SAS 612软件包。P<005为差异有显著性。

    2 结 果

    21 不同浓度和不同时间Ox|LDL作用于U937细胞后对LOX|1表达的影响将不同浓度的Ox|LDL（0~300 μg／ml）加入细胞培养液中，作用24 h后，用细胞酶联免疫法检测细胞表面LOX|1表达情况，实验发现LOX|1表达量随着Ox|LDL浓度增加和时间的延长呈递增后递减的趋势，在浓度为100 μg／ml，时间为24 h时表达量最明显（0965±0413）。见表1、2。表1 不同浓度Ox|LDL（氧化型低密度脂蛋白）作用于U937细胞后LOX|1的表达表2 100 μg/ml Ox|LDL不同时间作用于U937细胞后的LOX|1表达注：与0h比较*P<005。

    22 LOX|1阻断剂和卡托普利对LOX|1表达的影响前面已证实用Ox|LDL（100 μg／ml）作用24 h LOX|1表达最明显，作者用该浓度和时间作为阳性对照，药物组和阻断剂组分别在加入Ox|LDL前1 h加入，卡托普利的浓度为（10-5mol/L），LOX|1的阻断剂 PIA和角叉菜胶浓度为250 mg/L，应用细胞ELISA和Wstern blot作检测，结果应用药物和阻断剂后LOX|1的表达与Ox|LDL组相比明显减少。见表3。表3 LOX|1阻断剂PIA和角叉菜胶与卡托普利对LOX|1表达的影响注：与对照组比较△P<005;与Ox|LDL组比较#P<005。CAP：卡托普利。

　　3 讨 论

　 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化（AS）形成、发展中的关键，主要由血液来源的单核细胞转变为巨噬细胞，通过受体摄取Ox|LDL后转变而成。LOX|1是 Ox|LDL的一个受体[1]，它属于Ⅱ型单链跨膜蛋白，有一个短的N端胞浆亲水结构和一个长的C端胞外亲水结构域，中间为疏水区域，从结构上看属于C型选择素家族。LOX|1作为Ox|LDL的受体与以往的清道夫受体（如CD36）不同，它具有高度的配体特异性，它可以结合、内吞、降解Ox|LDL，但对天然低密度脂蛋白（nLDL）和乙酸化低密度脂蛋白（AC－LDL）则无作用[3]，表明Ox|LDL与LOX|1的结合是特异的，此过程可被LOX|1阻滞剂PIA和角叉菜胶抑制，但不被岩藻多糖或甲基化牛血清白蛋白抑制[4]。Ox|LDL可浓度依赖性的上调内皮细胞LOX|1的表达，这种上调作用可被反义LOX|1抑制，但不被顺义LOX|1所抑制[5]。在生理条件下LOX|1在主动脉内膜和富含血管的器官：如胎盘，肺，脑，肝等中都有表达[2]。在粥样硬化移植静脉的增生内膜和颈动脉粥样硬化斑块，LOX|1的蛋白质、mRNA表达均明显增加，且在粥样斑块核心新生血管亦有大量表达[6]。这提示LOX|1可通过介导Ox|LDL在AS甚至ACS的形成中起重要作用。 LOX|1作为Ox|LDL的特异性受体在人单核细胞不表达，当分化成巨噬细胞则有表达，但体外培养的人单核／巨噬细胞上LOX|1随着巨噬细胞的进一步分化，在 2－5 d呈递减趋势，因此认为LOX|1可能在单核细胞激活分化成巨噬细胞的早期发挥了摄取Ox|LDL的作用[7]，巨噬细胞表面的 LOX|1可能影响泡沫细胞形成，在 AS进程方面扮演了重要角色。本实验发现Ox|LDL作用于U937细胞，随着浓度增大和时间的延长LOX|1的表达呈先递增后递减趋势，初步证实Ox|LDL可促使U937细胞表面LOX|1的表达，应用LOX|1的化学阻断剂PIA和角叉菜胶，可使U937细胞表面的LOX|1表达明显减少，说明单核／巨噬细胞通过LOX|1摄取Ox|LDL进而促进泡沫细胞形成，促进AS的发生发展。 近来亦有研究表明，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）类药物对缺血再灌注损伤的细胞具有保护作用。血管紧张素Ⅱ可使LOX|1mRNA和蛋白质的表达增加［8，9］。ACEI可抑制 AngⅠ向AngⅡ的转换，从而下调 LOX|1，使细胞对Ox|LDL的摄取减少，起到对单核细胞的保护作用，进而减轻动脉粥样硬化[10]。本实验研究表明ACEI类药物卡托普利对Ox|LDL处理的细胞具有保护作用，表明ACEI类药物可使Ox|LDL受体表达减少，使其对Ox|LDL摄取减少，从而防止ACS的发生。

【参考文献】  [1]Sawamura T, Kume N, Aoyama T, et al An endothelial receptor for oxidized low|density lipoprotein[J].Nature,1997，386(1):73-77.

[2] Kume N，Moriwaki H, Katalka H, et al.Inducible expression of LOX|1, a novel receptor for oxidized LDL, in macrophages and vascular smooth muscle cells[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2000， 902:323-327.

[3] Kume N, Muase T, Moriwaki H, et alInducible expression of lectin|like oxidized LDL receptor-1 in vascular endothelial cells[J].Circulation Research，1998，83(3):322-327.

[4]Moriwaki H，Kume N, et alLigand specificity of LOX|1, a novel lectn|like receptor for oxidized low density lipoprotein[J].CircuIation，1997，96(8S)：104.

[5]Li Dayuan, Mehta JLUpregulation of endothelial receptor for oxidized LDL(LOX|1) by oxidized LDL and implications in apoptosis of human coronary artery endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2002，20:1116-1122.

[6]Li Dayuan, Chen Hongjiang, Staples ED,et alOxidized low|density lipopretein recepter LOX|1 and apotosis in human atherosclerotic lesions[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology & Therapeutics，2002， 7(3): 147-153.

[7]Draude G, Hrboticky N, Lorenz RLThe expression of the Iectin|like oxidized low|density lipoprotein receptor (LOX|1) on human vascular smooth muscle cells and monocytes and its down-regulating by lovastatin[J].Biochem Pharacol, 1999, 57(4):383-386.

[8]Nickenig,HarrisonThe AT1-Type angiotensin receptor in oxidative stress and atherogenesis:Part:oxidative stress and atherogenesis[J].Circulation，2002，105(3):393-396.

[9]Morawietz H,Rueckschloss U,Niemann B,et alAngiotension Ⅱ induces LOX|1,the human endothelial receptor for oxidezed low|density lipoprotein[J].Circulatin，1999，100(9):899.

[10]Rueckschloss U, Morawietz H,Hadi H,et alThe endothelial receptor for oxidized low|density lipoprotein is downregulated in arteries of patients under therapy with angiotensin converting enzyme inhibitors[J].Circulation，1997,96(8S):21.