C反应蛋白与肾小管间质纤维化关系研究

　　作者：李灿 ，金英顺 ，陈瑛，梁哲宇

　　[摘要] [目的] 探讨C反应蛋白(CRP)与慢性环孢素A(CsA)肾毒性肾小管间质纤维化的关系. [方法] 给雄性Sprague-Dawley大鼠皮下注射CsA4周，建立慢性CsA肾毒性动物模型.采用胶乳增强免疫比浊法、免疫比浊法以及免疫组织化学染色方法检测对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清高敏CRP(hs-CRP)、CRP及肾内CRP的水平;采用三色染色方法观察肾小管间质纤维化程度;以直线相关分析法对CRP与肾小管间质纤维化程度间的关系进行分析. [结果] 慢性CsA肾毒性组与对照组血清CRP和hs-CRP的含量水平间无显著性差异，与肾小管间质纤维化程度无相关关系;慢性CsA毒性组大鼠肾内CRP的表达显著高于对照组，与肾小管间质纤维化程度呈正相关(r=0.862). [结论] 慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化与肾内CRP的表达水平密切相关，与血清CRP的含量无关.

　　[关键词] 肾小管间质纤维化;C反应蛋白;大鼠

　　Relationship between C-reactive protein and tubulointerstitial fibrosis

　　LI Can 1 ，JIN Ying-shun 1 ，CHEN Ying 1 ，YANG Chul-woo 2

　　(1.Department of Interrenal Medicine，Affiliated Hospital of Yanbian University，Yanji133000，Jilin，China;2.Department of Interrenal Medicine，KangNam St.，Mary's Hospital，The Catholic University of Korea，Korea)

　　ABSTRACT:OBJECTIVE To study the relationship between C-reactive protein(CRP)and tubulointerstitial fibrosis(TIF)in a model of chronic cyclosporine(CsA)nephrotoxicity.METHODS Chronic CsA nephrotoxicity was induced in Sprague-Dawley rats by administering CsA for4weeks.Serum CRP，high sensitivity-CRP(hs-CRP)，and intrarenal CRP of rats in control group and CsA treatment group were evaluated with particle-enhanced immunoturbidometric method and immunohistochemistry.TIF was measured by Masson trichrome stain.The relationship between CRP and TIF was analyzed by the Pearson single-correlation coefficient.RESULTS There were no significant differences in CRP and hs-CRP levels between two groups.Moreover，there was no relationship between serum CRP and TIF，intrarenal CRP expression was markedly increased in CsA-treated rat kidneys compared with control，and that was correlated with the TIF score(r=0.862).CONCLUSION Intrarenal CRP level but not serum CRP is closely associated with TIF in chronic CsA nephrotoxicity.

　　Key words:tubulointerstitial fibrosis;C-reactive protein;rats

　　C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是在急性炎症病人血清中发现的急性期蛋白，它可通过补体活化、组织损伤及内皮细胞活化等途径放大炎性反应.急性创伤或感染发生时，血CRP浓度急剧升高，可达到正常水平的1000余倍，病情好转时又迅速下降至正常水平.因此，CRP不但被认为是心血管及肾脏疾病的急性相反应指标，而且监测它还可预测相关疾病的病情严重程度 [1] .本实验组曾利用动物模型研究发现，长期使用CsA可导致肾脏持续性炎症介质表达的上调及炎性细胞的浸润，此炎症反应与肾小管间质纤维化密切相关 [2～4] .本研究通过检测大鼠血CRP水平，探讨了其与慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化间的关系.

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型的构建 取雄性Sprague-Dawley大鼠16只，体重为200～220g，喂饲低盐饲料(0.5g/L钠盐，Teklad Premier，Madison，WI，美国)，随机分为对照组及慢性CsA肾毒性组，每组各为8只.给对照组大鼠每日皮下注射1mL/kg橄榄油(Sigma)，给慢性CsA肾毒性组大鼠每日皮下注射15mg/kg CsA(Novartis Pharma，Basel，瑞士)，时间为4周.

　　1.2 肾功能测定 将大鼠放入代谢笼中，采血，收集24h尿液，用7150型全自动生物化学分析仪测定血清肌酐(Scr)含量，用Jaffe比色法测定24h尿肌酐含量，用下列公式计算内生肌酐清除率(creatinice clearance，Ccr): Ccr(%)=24h尿量×尿肌酐 血清肌酐 ×100

　　1.3 血清CRP含量的测定 采用胶乳增强免疫比浊法检测血清hs-CRP，CRP含量 [5] .由韩国天主教大学江南玛丽医院梁哲宇教授提供原始数据.

　　1.4 肾脏病理检查 用碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液(periodate-lysine-paraformaldehyde，PLP)固定大鼠肾组织，石蜡包埋后切片，厚度为4μm，脱蜡，行三色染色.肾小管间质纤维化程度判定:每张切片至少观察20个非重叠区域，用数字显微镜分析仪(Olympus，日本)以每个视野为100%利用Polygon

　　程序计算出纤维化百分率，并计算其平均值. 1.5 免疫组织化学染色 将石蜡包埋的切片置于二甲苯脱蜡，梯度酒精中脱水，在室温下经3g/L过氧化氢及100g/L甲醛处理30min，用PBS洗涤3次，置于微波炉中加热5min(抗原修复)，用PBS洗涤3次，室温下滴加非免疫性血清封闭液处理20min，用PBS洗涤3次，在4℃条件下滴加一抗(ED-1，Sigma，美国)，在室温孵育12～16h，用PBS液洗涤3次，滴加二抗，继续孵育2～3h，以DAB为底物显色至颜色呈棕黄色为止;自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片，用数字显微镜分析仪计数ED-1，CRP阳性细胞数.

　　1.6 统计学处理 计量资料用均数±标准偏差表示(x±SD)，两样本均数间比较采用t检验.CRP含量与肾小管间质纤维化程度的关系的分析用直线相关分析，采用SPSS12.0软件进行.

　　2 结果

　　慢性CsA肾毒性组大鼠肾功能明显降低，表现为Scr为(109.3±11.7)μmol/L，与对照组大鼠的(57.1±1.9)μmol/L相比明显上升，Ccr为(1.5±0.2)mL?min -1 ?kg -1 ，与对照组大鼠的(5.1±0.6)mL?min -1 ?kg -1 相比明显下降，两组Scr，Ccr值间均有显著性差异(P<0.01).慢性CsA肾毒性组大鼠肾组织肾小管间质纤维化百分率为36%±3%，而对照组大鼠则无肾小管间质纤维化(图1);慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质内可观察到大量的ED-1阳性细胞浸润(54个±9个)，与对照组(11个±1个)比较有显著性差异(P<0.01，图2);对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清CRP含量分别为(21.6±1.14)，(21.6±1.13)mg/L，Hs-CRP含量分别为(2.4±0.09)，(2.5±0.19)mg/L，两组间无显著性差异(P>0.05);免疫组织化学染色结果表明，慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP表达及免疫活性明显增强，CRP阳性细胞数为(62±6)个，集中于受损区域的肾小管上皮细胞，对照组为(24±2)个，两组间有显著性差异(P<0.01，图3).直线相关分析结果表明，血清CRP，hs-CRP含量与肾小管间质纤维化程度无相关关系(r=0.054，P=0.844;r=0.027，P=0.919)，而肾内CRP阳性细胞数与肾小管间质纤维化程度有较强的正相关关系(r=0.862，P<0.001). 图1 三色染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质纤维化 ×100 图2 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒 性组大鼠肾小管间质炎性细胞浸润 ×400 图3 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP的表达 ×100

　　3 讨论

　　慢性CsA肾毒性是在肾疾病中较常见的并发症，特别在肾移植病人中的发病率占慢性移植肾肾病的6% [6] .本研究利用慢性CsA肾毒性动物模型，检测了慢性CsA肾毒性肾疾病大鼠系统及局部CRP含量，分析了CRP与肾小管间质纤维化程度间的关系，结果表明对照组和慢性CsA肾毒性组大鼠血清CRP，hs-CRP水平无显著性差异，但慢性CsA肾毒性组肾内CRP表达和免疫活性却明显增 强.相关分析结果表明，肾内CRP阳性细胞数与纤

　　维化程度密切相关，提示肾内CRP可反映慢性CsA肾毒性肾小管间质的受损程度.曾方银等 [7] 检测了56例肾移植患者术前及术后不同时间血清CRP含量，同时检测了血尿素氮及血肌酐水平，结果表明肾移植患者术前血CRP含量与正常人无显著性差异，而术后第1日则开始明显升高，并于第2日达到峰值，第4日开始下降，第12日降至术前水平，即血CRP含量的总体变化趋势与肾功能恢复情况基本一致.另据报道，非糖尿病性病人的肾功能进展与升高的血CRP含量间无相关性 [8] .本实验组认为血清CRP含量可在应激状态下升高，但在慢性过程中降至正常.一般认为CRP主要在肝脏内合成，可激活补体，介导巨噬细胞吸收低密度脂蛋白 [9] ，并且可引起血管内皮细胞黏附分子1的高表达，诱导单核细胞趋化蛋白1的产生，从而介导炎症反应 [10] .近期研究结果表明，除肝脏外肾脏亦可生成CRP [11] .与人类不同，大鼠CRP不是典型的急性期蛋白，在基础状态下含量较人类高出100倍左右 [12] .本研究利用特异性抗体，采用免疫组织化学方法检测了肾内CRP的免疫活性，结果表明在显示对照组大鼠肾组织内可检测到少量CRP的表达，而在慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP的表达和免疫活性明显增强，且主要集中在受损区域的肾小管上皮细胞.综上所述，在慢性CsA肾毒性肾疾病中，肾小管间质纤维化与肾内CRP的表达水平密切相关，而与血清CRP水平无相关性.

　　[参 考 文 献]

　　[1] Blake GJ，Ridker PM.Inflammatory bio-marker and car-diovascular risk prediction[J].J Intern Med，2002，252:283.

　　[2] 李灿，陈瑛，洪明玉.药物中断对慢性环孢素A肾毒性可逆性的机制研究[J]. 中华肾脏病杂志 ，2003，19:315.

　　[3] Li C，Yang CW，Ahn HJ，et al..Colchicine suppressesosteopontin expression and inflammatory cell infiltration in chronic cyclosporine nephrotoxicity[J].Nephron 2002，92:422.

　　[4] Li C，Yang CW，Kim WY，et al..Reversibility of chronic cyclosporine nephropathy in rats after withdrawal of cyclosporine[J].Am J Physiol Renal Physiol，2003，284:F389.

　　[5] Chang JW，Yang WS，Min WK，et al..Effects of sim-vastatin on high-sensitivity C-reactive protein and serum albumin in hemodialysis patients[J].Am J Kidney Dis，2002，39:1213.

　　[6] Mourad G，Vela C，Ribstein J，et al..Long-term im- provement in renal function after cyclosporine reduction in renal transplant recipients with histologically proven chronic cyclosporine nephropathy[J].Transplantation， 1998，65:661.

　　[7] 曾方银，何莹，王前，等.肾移植受者血清C-反应蛋白动态变化及其临床意义[J]. 临床检验杂志 ，2002，20:77.

　　[8] Sarnak MJ，Poindexter A，Wang SR，et al..Serum C-reactive protein and leptin as predictors of kidney dis-ease progression in the modification of diet in renal disease study[J].Kidney Int，2002，62:2208.

　　[9] Zwaka TP，Hombach V，Torzewski J.C-reactive pro- tein-mediated low density lipoprotein uptake by macrophages:implications for atherosclerosis[J].Circula-tion，2001，103:1194.

　　[10] Pasceri V，Willerson JT，Yeh ET.Direct proinflamma- tory effect of C-reactive protein on human endothelial cells[J].Circulation，2000，102:2165.

　　[11] Jabs WJ，Logering BA，Gerke P，et al..The kidney asa second site of human C-reactive protein formation in vi-vo[J].Eur J Immunol，2003，33:152.

　　[12] Diaz Padilla N，Bleeker WK，Lubbers Y，et al..RatC-reactive protein activates the autologous complement system[J].Immunology，2003，109:564.

　　(1.延边大学医院肾内科，吉林延吉133000;2.韩国天主教大学江南玛丽医院肾内科，韩国)