白细胞介素-6 对人冠脉平滑肌细胞表达M M P -3 和P A PP -A 基因的影响

作者:高德路,夏爱祥,张清华

作者单位：解放军第305 医院，北京市　100017          【摘要】  　　目的：探讨炎症因子白细胞介素-6 （IL -6 ）对人冠脉平滑肌细胞表达基质金属蛋白酶-3 （M M P -3 ）、妊娠相关血浆蛋白-A （P A PP -A ）基因的影响。方法：（1 ）应用相同浓度的IL -6 （10ng／ml）刺激人冠脉平滑肌细胞，分别在共同培养0h ，2h ，4h ，8h ，24h ，36h 后收集细胞，观察细胞因子的时间效应；（2 ）应用不同浓度的IL -6 （0ng／ml，5ng／ml，10ng／ml，50ng／ml）刺激人冠脉平滑肌细胞，共同培养6 h 后收集细胞，观察细胞因子的剂量效应；（3 ）应用实时荧光定量聚合酶链反应（PC R ） 的方法检测细胞内M M P -3 、P A PP -A 基因的表达量。结果：相同浓度IL -6 刺激时，人冠脉平滑肌细胞M M P -3 和P A PP -A 基因的表达量在2h 时开始发生上调，8h 左右达高峰，而后开始下降；随着IL -6 剂量加大，M M P -3 、P A PP -A 基因表达量呈上升趋势（M M P -3 ：r=01919 ，P =01000 ；P A PP -A ：r=01941 ， P =01000 ）。结论：炎症因子IL -6 能促进冠脉平滑肌细胞中斑块稳定相关标记物M M P -3 和P A PP -A 表达，可能是炎症在急性冠脉综合征发生发展中起重要作用机制之一。

     【关键词】  冠状动脉疾病；白细胞介素-6 ；基质金属蛋白酶-3 ；妊娠相关血浆蛋白-A

　　Influence ofinterleukin -6 on matrix metalloproteinase -3 and pregnancy2associated plasma protein -A gene expression inhuman coronary artery smooth muscle cells

　　G A O De　lu ，XIA Ai　xiang ，Z H A N G Qing　hua ，JIA N G Zhi　xin ，LI An　quan ，W A N G Hui2zhong

　　Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine ，2007 ，16 （4 ）：337

    Abstract：Objective ：To probe the effect of IL -6 on matrix metalloproteinase -3 （M M P -3 ），pregnancy2associated plasma protein -A （P A PP -A ）gene expression in hu man coronary artery smooth m uscle cells .M ethods ：（1 ）madeuse of IL -6 （10ng／ml）to stim ulate hu man coronary artery smooth m uscle cells ，co2cultured for 0h ，2h ，4h ，8h ，24h ，36h ；（2 ）utilized IL -6 （0ng／ml，5ng／ml，10ng／ml，50ng／ml）to stim ulate hu man coronary artery smooth m uscle cells ，co2cultured for 6h ；（3 ）Detected the gene expression by fluorescent quantitation PC R .Results ：（1 ）inthe same concentration of IL -6 ，gene expression will be up2regulation at 2 h ，at 8 h the expression get to the peak ，then begin to descent；（2 ）in different concentration of IL -6 ，gene expression was up2regulation with the dose of IL-6 （M M P -3 ：r=01919 ， P =01000 ；P A PP -A ：r=01941 ， P =01000 ）.Conclusion ：The results suggest that IL -6 can pro mote M M P -3 ，P A PP -A gene expression in hu man coronary artery smooth m uscle cells ，and it maybe one of the mechanisms for inflam mation has significant effectin acute coronary syndrome .

    Key words ：Coronary artery disease ；Interleukin -6 ；M etalloproteinase -3 ；Pregnancy2associated plasma protein -A

　　研究表明炎症在急性冠脉综合征（A CS ） 发生发展中起着非常重要的作用。A CS 的发生和不稳定与斑块破裂有关。基质金属蛋白酶-3 （M M P -3 ）能降解细胞外基质，在不稳定斑块形成中有非常重要作用。妊娠相关血浆蛋白-A （P A PP -A ） 是新发现的参与斑块不稳定化的血清标志物。本研究应用炎症因子白细胞介素-6 （IL -6 ） 刺激人冠脉平滑肌细胞，观察其对M M P -3 、P A PP -A 基因表达的影响，从而验证炎症在A CS 中的作用。

    1 资料与方法

    1.1 实验材料

    （1 ） 细胞： 人冠脉平滑肌细胞［H C A S M C ］（Casecade 公司）；（2 ） 试剂：231 培养液、培养液添加剂及胰酶（Casecade 公司），IL -6 （Peprotech公司），T RIZ O L 试剂（Invitrogen ，美国）、脱氧三磷酸腺苷（dA T P ） 试剂， 脱氧胞苷三磷酸（dC T P ），脱氧三磷酸鸟苷（dG T P ）， 三磷酸去氧胸苷（dT T P ）（Pro mega ，美国）、Oligo （dT ）15-18 引物（ 上海生工生物科技有限公司）、M -M L V 逆转录酶（Invitrogen ， 美国）、溴化乙锭（Sig ma ， 盖）、加样缓冲液（ Takars ， 日本）、SY B R Green PC R 标准试剂盒（A pplied Biosys2tems ，美国）；（3 ） 仪器：M C O -17 AIC O 2 恒温培养箱（S A N Y O ， 日本）、C K2 型倒置显微镜（O2ly m pus ，日本）、细胞超净工作台（ 北京昌平长城空气净化工程公司）、Ultrospec 3100pro 型紫外分光光度计（A mersham Pharmacia Biotech ， 英国）、D Y C -31D 型电泳仪（北京六一仪器厂）、G E L -D O C2000 型紫外凝胶成像系统（Bio -Rad ，美国）、7500 型实时荧光定量PC R 仪及分析软件SDS （A p2plied Biosystems ，美国）。

    1.2 实验方法

    1.2.1 细胞培养及因子刺激：复苏的细胞在37 ℃，95 %空气和5 %C O 2 的培养箱中培养。实验用5 ， 7代的细胞。将细胞按1 ×104／cm 2 的密度接种于25cm 2 的培养瓶中，24 h 后换液，培养48 h 后细胞接近80 %融合时加入IL -6 ，进行刺激。（1 ） 同时在6 瓶细胞中按10ng／ml 加入细胞因子，分别在刺激后0 ，2 ，4 ，8 ，24 ，36 h 后收集上清液和细胞；

    （2 ） 按0ng／ml、5ng／ml、10ng／ml、50ng／ml 加入刺激因子，6 h 后收集上清液和细胞。上清液-70 ℃冻存，细胞用生理盐水冲洗两遍后用T RIZ O L消化。实验分两期，于2005 年5 月， 2006 年6 月在解放军305 医院老年病中心实验室完成。

    1.2.2 　细胞总R N A 提取： 采用细胞总R N A T R2IZ O L 试剂提取R N A ，严格按照试剂说明书进行提取操作。

 1.2.3 　cD N A 的合成：取5μl 总R N A 进行逆转录反应，严格按照M -M L V 逆转录酶说明书操作。

    1.2.4 　荧光定量PC R 引物应用软件（Primer 5 和Oligo 6 ）自行设计，P A PP -A 长度141 bp ，F ：5′- G A G G A G T T G G C A G G A G T A G C A -3′；R ：5′-G C CC A G G C T G G C T G T G A C C A A T -3′；M M P -3长度为186 bp ，F ：5′- T A T G G A CC T C C C C C T2G A C T C C -3′；R ：5′- A G G T T C A A G C T T C C T2G A G G -3′。看家基因（G A P D H ）为108 bp ，F ：5′-C A T C C A T G A C A A C T T T G G T A T C -3′，R ：5′-CC A T C A C G C C A C A G T T T C -3′（北京赛百盛科技有限公司制备合成）。反应条件如下：50 ℃ 2 min ，95 ℃10 min（95 ℃15s +60 ℃65s ）×50 循环。

    1.3 　统计学方法

    应用SPSS 1010 软件进行统计学描述与分析，所得数据用均数±标准差（珚x ±s） 表示，不同时间基因表达量应用Excel 软件作出变化趋势图， 不同剂量组比较用一步O N O V A 检验， 两两比较法检验，并进行spearman 相关分析，P ＜ 0105 为差异有显著性。

    2 　结　果

    2.1 　细胞总R N A 质量及纯度检验

    （1 ）每份样品取4μl， 测定其A260 n m／A280n m 吸光度比值，结果均在118 ， 210 之间，说明所提R N A 纯度较高；（2 ）取稀释后的R N A 1μl 与加样缓冲液混匀后，在1 %的琼脂糖凝胶中电泳图片上可见R N A 清晰的18 s 和28 s 的条带，无弥散，说明R N A 质量较好，无明显降解（见图1 ，图2 ）。

    2.2 目的基因的表达情况

    在相同浓度的时间效应中，人冠脉平滑肌细胞M M P -3 和P A PP -A 基因的表达量在2 h 时开始发生上调，8 h 左右达高峰，而后开始下降；在不同剂量IL -6 刺激下，M M P -3 、P A PP -A 基因随剂加大表达量呈上升趋势（ M M P -3 ：r =01919 ，P =01000 ；P A PP -A ：r=01941 ，P =01000 ）。不同剂量组M M P -3 、P A PP -A 的表达量有显著性差异（M M P -3 ：F =141081 ，P =01001 ；P A PP -A ：F =251128 ，P =01000 ），见表1 ，图3 ，图4 。在5μg／L 和 10μg／L 组间M M P -3 、P A PP -A 基因表达量没有显著性差异（M M P -3 ：P =01292 ；P A PP -A ：P =01065 ），其余各组间均有显著性差异。

    3 讨　论

    研究发现斑块的破裂、糜烂、出血并在此基础上促使冠脉痉挛和血栓形成，是A CS 主要的发病机制。这些易于破裂的斑块具有较大的偏心的不规则脂质核心，纤维帽较薄，并富含炎症细胞及炎症相关细胞，具有较高的不稳定性［1 ］。研究表明炎症在不稳定斑块的发生、演变及破裂过程中起着至关重要的使用［2 ，3 ］。炎症反应的激活是导致斑块不稳定的主要因素，局部炎症细胞的浸润以及全身炎症是导致斑块破裂的最主原因。IL -6 是一种多功能的细胞因子，产生于活化T 淋巴细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等，参与炎症免疫过程。Deliangy 等［4 ］发现A CS 时水平升高的IL -6 主要来源于心脏， 并且循环中的IL -6水平和患者的预后密切相关。IL -6 能够趋化、活化中性粒细胞和单核细胞， 增强局部的炎症反应；干扰脂质代谢和介导细胞凋亡，诱导肝细胞合成纤 维蛋白原，C R P 等急性期蛋白；促进血管内皮细胞释放第3 凝血因子，启动凝血过程并能够刺激肝细胞产生血浆纤溶酶原激活物抑制物，促进血栓的形成［5 ］；刺激基质降解酶的合成，侵蚀斑块内的基质，从而导致斑块不稳定。

    M M P 是一组依赖于Zn2 + 、Ca2 + 的蛋白酶超家族，对细胞外基质（E C M ）成分有较高亲和力，几乎可降解所有E C M 成分，使动脉硬化斑块纤维帽变薄，趋于不稳定并最终破裂，导致引发A CS 。近来研究发现A CS 患者血浆［6 ， 8 ］，甚至在尿液［9 ］及唾液［10 ］中M M P 家族成员分泌水平升高，提示它可能参与A CS 病理进程， 可作为斑块稳定性标记物。

    Tayebjee 等［11 ］研究发现， 高血压患者M M P -9 和基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIM P ）-1 基线水平升高，在进行了心血管危险因素处理后，M M P -9 水平下降，而TIM P -1 水平升高，并且M M P 水平升高和高Framingham 心血管危险因子积分显著相关。临床应用血脂康［12 ］、阿托伐他汀［13 ］、复方丹参［14 ］、环氧化酶抑制剂［15 ］等能够降低A CS 患者血浆M M P 水平。在众多M M P 中，M M P -3 显得尤为重要，因为其底物广泛， 可以单独降解E C M 的大部分成分， 同时又可以激活M M P -1 、M M P -8 、M M P -9 的活性［16 ］，共同参与E C M 降解过程。

    M M P -3 与能够激活的其他酶原形成一正反馈环，在M M P 家族激活过程中具有关键作用。刘丹［17 ］等研究发现M M P -3 水平在A CS 患者中显著升高。

    本研究中发现IL -6 能够在基因转录水平上调人冠状动脉平滑肌细胞中M M P -3 表达，具有剂量依赖效应。研究结果提示不稳定斑块中细胞因子和炎症反应的存在可能是M M P 表达上调的原因。

    P A PP -A 是M M P 超家族的新成员［18 ］，除具有M M P 的活性外，还通过P A PP -A ，胰岛素样生长因子结合蛋白（IG FBP ）-4 和胰岛素样生长因子（IG F ）-Ⅰ ／胰岛素样生长因子-Ⅰ 受体（IG F -IR ）构成的信号转导系统发挥生物学作用。近年来发现人体中血管平滑肌细胞、巨噬细胞、细胞外基质、单核细胞和血管内皮细胞中均存在P A PP -A 的表达［19 ］。2001年Buyes -Gems 等［20 ］对8 个死于心脏突发事件的8个血管的不稳定斑块及4 个稳定斑块进行P A PP -A 检测，发现在不稳定斑块细胞中及细胞外基质中有大量表达，而稳定斑块则没有。且在最易于破裂的斑块肩部，P A PP -A 表达却最丰富，提示可能参与粥样斑块的破裂过程，但具体机制不清。随后的大量研究发现，P A PP -A 是不稳定斑块的新的标志物，并不受调脂治疗的影响［21 ］。生理情况下，体内的IG F-Ⅰ 与其接合蛋白IG FBP -4 相结合，其生物活性受到抑制。P A PP -A 则是其结合蛋白的裂解酶，裂解后的IG FBP -4 失去对IG F 的抑制作用，使IG F 与其受体结合，发生信号转导，产生血管平滑肌细胞（V S M C ）迁移，增殖分化等生物学效应，从而促进动脉粥样硬化的形成和发展，使危险斑块的不稳定增加，促进心肌的缺血和坏死。同时IG F 还是V S M C有丝分裂原，刺激V S M C 的迁移和增殖，导致血管内皮的增生和狭窄。本研究模拟不稳定斑块的局部条件，应用IL -6 刺激人冠状动脉平滑肌细胞，结果提示炎症因子能够在基因转录水平上调平滑肌细胞中P A PP -A 的表达，并且呈剂量依赖效应，本结果与最近Conover 等［22 ］的研究类似；解释了临床研究中P A PP -A 水平和炎症因素显著相关的现象，以及病理研究中为何P A PP -A 在炎症反应强烈的不稳定斑块和破裂斑块中大量表达，而在炎症反应很少的稳定斑块中不表达。提示P A PP -A 介导的IG F 轴的生物活性可能是炎症在A CS 发生、发展中的重要作用机制之一。不稳定斑块中有大量的炎性细胞聚集（尤其是激活的巨噬细胞和泡沫细胞），能够分泌大量活性炎症介质，刺激结合部（肩部）的平滑肌细胞合

成P A PP -A ，使斑块易于破裂。斑块破裂后P A PP-A 快速的释放入血，导致A CS 患者早期血清P A PP -A 水平的升高［23 ］，这与临床研究发现A CS患者的血清P A PP -A 水平升高相一致。

【参考文献】  ［1 ］Davies M J .Pathophysiology of acute coronary syndrome ［J ］.H eart ，2000 ，83 （4 ）：361 -366 .

［2 ］Ross R .Atherosclerosis2an inflam matory disease［J ］.New EnglJ M ed ，1999 ，340 （2 ）：1.5 　 -126 .

［3 ］Biasucci L M ，Colizzi C ，Rizzello V ，et al.Ro1e of inflam mationin the pathogenesis of unstable coronary artery diseases ［J ］.Scand J Clin Lab Invest ，1999 ，59 （S230 ）：12 -22 .

［4 ］Deliargyris E N ，Ray mond RJ ，Theoharides T C ，et al.Sites ofinterleukin -6 release in patients with acute coronary syndromesand in patients with congestive heart failure ［J ］.A m J Cardiol，2000 ，86 （9 ）：913 -918 .

［5 ］Cruickshank A M ，OIdroyd K G ，Cobbe S M .Seru m interleukin-6 in suspected m yocardialinfarction ［J ］.Lancet ，1994 ，343（8903 ）：974 .

［6 ］Ding SF ，Zhang Y ，Zhang M ，et al.The role of atheroscleroticplaque stability and inflam mation in the pathogenesis of acute cor2onary syndrome［J ］.中华心血管病杂志，2006 ，34 （6 ）：512 .

［7 ］Zhou ZX ，Qiang H ，M a A Q ，et al.M easurement peripheral blood index related to inflam mation and ox -L D L ，ox -L D L Abin patients with coronary heart disease and its clinical significance［J ］.中南大学学报（医学版），2006 ，3l（2 ）；258 -262 .

［8 ］LiJ ，Zhao SP ，Peng D Q ，et al.Changes and relations of solubleplasma C D40L and matrix metalloproteinase -9 levels in patients

with coronary heart disease［J ］.中南大学学报（医学版），2004 ，29 （5 ）：517 -520 .

［9 ］Fitzsim mons PJ ，Forough R ，Lawrence M E ，et al.Urinary levelsof matrix metalloproteinase 9 and 2 and tissue inhibitor of matrixmetalloproteinase in patients with coronary artery disease ［J ］.Atherosclerosis ，2006 ，28 ：［Epub ahead of print］.

［10 ］Furuholm J ，Sorsa T ，Qvarnstrom M ，et al.Salivary matrixmetalloproteinase -8 in patients with and without coronary heartdisease may indicate an increased susceptibility to periodontal dis2ease［J ］.J Periodontal Res ，2006 ，41（5 ）：486 -489 .

［11 ］Tayebjee M H ，Nadar S ，Blann A D ，et al.M atrix metallopro2teinase -9 and tissue inhibitor of metalloproteinase2lin hyperten2sion and their relationship to cardiovascular risk and treatment ：asub2study of the Anglo2Scandinavian cardiac outcomes trial（A S2C O T ）［J ］.A m J H ypertens ，2004 ，17 （9 ）：764 -769 .

［12 ］H uang J ，W ang M H ，Peng X P ，et al.Effects of Xuezhikang on

seru m levels of high sensitive -C reactive protein ，matrix metal2loproteinase -9 and lipoprotein in patients with acute coronarysyndrome［J ］.中国中西医结合杂志，2006 ，26 （3 ）：221 .

［13 ］Dong S H ，W en J M ，Luo LJ ，et al.The effects of 40 mg atorv2astatin on seru m lipids ，inflam matory markers and clinical eventsin A CS patients post PCI［J ］.中华心血管病杂志，2006 ，34（4 ）：353 -356 .

［14 ］曹　源，舒晓春，吴贻金，等.复方丹参对冠心病基质金属蛋白酶-9 和肿瘤坏死因子-α 的影响［J ］.心血管康复医学杂志，2005 ，14 （4 ）：319 -321 .

［15 ］Deng P ，Zhao SP ，H uang H G ，et al.Significance and expres2 sion of cyclooxygenase -2 m R N A in peripheral blood m onocytes in patients with acute coronary syndrome ［J ］.中南大学学报（医学版），2005 ，30 （4 ）：403 -406 .

［16 ］Galis ZS ，Sukhova G K ，Kranzhofer R ，et al.M acrophage foamcells fro m experimental atheroma constitutively produce matrix -degrading proteinases ［J ］.Proc Natl Acad Sci U S A ，1995 ，92（2 ）：402 -406 .

［17 ］刘　丹， 张清华，蒋知新， 等.超敏C 反应蛋白、M M P -3与TI M P -1 在急性冠脉综合征的表达［J ］.实用医药杂志，2006 ，22 （4 ）：296 -298 .

［18 ］Jones JI ，Clem mons D R .Insulin2like growth factors and theirbinding proteins ：biological actions ［J ］.Endocr Rev ，1995 ，16（1 ）：3 -34 .

［19 ］Overgaard M T ，Oxvig C ，Christiansen M ，et al.M essenger ri2bonucleic acid levels of pregnancy2associated plasma protein -Aand the proform of eosinophil major basic protein ：expression inhu man reproductive and nonreproductive tissues ［J ］.Biol Re2prod ，1999 ，61 （4 ）：1083 -1089 .

［20 ］Bayes2Genis A ，Conover C A ，Overgaard M T ，et al.Pregnancy2associated plasma protein A as a marker of acute coronary syn2dromes ［J ］.N Engl J M ed ，2001 ，345 （14 ）：1022 -1029 .

［21 ］Ceska R ，Stulc T ，Zima T ，et al.P A PP -A ，a novel marker ofunstable plaque ，is not influenced by hypolipidemic treatment incontrast to C R P ［J ］.Atherosclerosis ，2003 ，166 （1 ）：195 .

［22 ］Conover C A ，Bale L K ，H arrington SC ，et al.Cytokine stim ula2tion of pregnancy -associated plasma protein A expression in hu2man coronary artery sm ooth m uscle cells ：inhibition by resvera2trol［J ］.A m J Physiol Cell Physiol，2006 ，290 （1 ）：183 .

［23 ］Lund J ，Qin Q P ，Ilva T ，et al.Pregnancy2associated plasmaprotein A ：a biomarkerin acute ST -elevation m yocardialinfarc2tion（ST E MI）［J ］.Ann M ed ，2006 ，38 （3 ）：221 -228 .