肾小管上皮细胞间充质转分化 分子机制的研究进展

　　作者：周凌 作者单位：东南大学附属中大医院 肾内科，江苏 南京 210009

　　【关键词】 肾间质纤维化 转分化 信号传导

　　肾间质纤维化是多种肾脏疾病发展到一定阶段常见的病理改变,其严重程度不仅影响肾功能,而且与肾病的预后有着密切联系。肾间质的基质成分由成纤维细胞合成分泌,研究表明,肾间质成纤维细胞主要有3个来源：(1)肾脏固有的间质成纤维细胞;(2)循环而来的间充质细胞;(3)肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)。其中EMT在肾小管间质纤维化中的作用正越来越受到重视,作者对EMT分子机制的研究进展进行综述。

　　1 概 述

　　EMT是指在病理情况下肾小管上皮细胞外环境改变，维持生理功能的细胞因子之间失去平衡，保持上皮细胞形态的基因表达受到抑制，表达肌成纤维细胞表型的基因得到释放，肾小管上皮细胞基底膜受到破坏，细胞失去其原有上皮特征转变为间充质表型。细胞失去离子及液体转运功能转变成重塑基质的肌成纤维细胞。这个过程中细胞间起黏附作用的E钙黏蛋白、紧密连接蛋白(zonula occludentes protein, ZO1)减少,出现间充质标识,如成纤维细胞特异性蛋白1(fibroblast specific protein1,FSP1) [1]、波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,αSMA)等,具有了迁移特性。

　　胚胎时期,MET(mesenchymal  epithelial transition)是肾脏形成中重要的生理活动。大部分小管上皮由MET形成[2]。肾小管上皮细胞在形态及功能上具有一定的可塑性,肾脏损伤时细胞通过发生EMT逃避死亡, 病因及时去除,EMT可逆转，如果致病因素长期存在,肌成纤维细胞合成分泌大量胶原,细胞外基质聚积排列紊乱,EMT则不易逆转[3]。

　　2 促进EMT发生的细胞外因子

　　缺血缺氧、炎症、免疫系统疾病可引起肾脏局部内环境改变。炎症细胞及肾脏固有细胞合成分泌多种细胞因子及酶类,活性成分使内环境紊乱，转分化因子与逆转分化因子之间失去平衡，导致EMT的发生。涉及的因子有转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGFβ)、结缔组织生长因子(connective tissure growth factor,CTGF)[4]、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor ,FGF)、血小板源性生长因子(plateletderived growth factor,PDGFBB)[5]、白细胞介素1(interleukins1,IL1) [6]、单核细胞趋化因子1(monocyte chemoattractant protein1,MCP1) 、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)等。酶包括基质金属蛋白酶(metalloproteinase,MMP)[7]及纤溶酶。此外血管紧张素Ⅱ、糖基化终产物(advanced glycation end products,AGE)[8]、巨噬细胞分泌的制瘤素M(oncostatin M)[9]、活性氧 (reactive oxygen species, ROS)[10]亦可引起EMT。

　　3 EMT的细胞内信号转导机制

　　TGFβ在体外是最有效的引起EMT的因子，它的信号转导通路也研究得比较多。TGFβ的受体是丝/苏氨酸激酶受体(Ⅰ,Ⅱ), TGFβ通过Smads系统进行信号转导。TGFβ与Ⅱ型跨膜受体结合,Ⅰ型受体磷酸化, 活化后的Ⅰ型受体磷酸化Smad2和Smad3。磷酸化的Smad2/3与Smad4形成复合物,进入核调节TGFβ靶基因转录[11]。Smad2/3磷酸化后产生的效应不同,Smad2能增加MMP2的表达,Smad3增加结缔组织生长因子(CTGF)的表达,抑制E钙黏蛋白的表达,两者协同则能上调αSMA的表达[12]。除此之外，TGFβ还能激活其他信号转导通路，包括P38分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)、Akt/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)、RhoA及β连接素。然而，过度表达Smad7能阻断Smad2的磷酸化并能逆转EMT，说明Smads是TGFβ的主要信号转导途径。

　　Smad的下游信号转导途径是最近研究的热点，整合素联结激酶(integrinlinked kinase,ILK)是Smad下游重要的信号转导通路。ILK是细胞内的丝/苏氨酸蛋白激酶，它与β整合素及细胞骨架蛋白相互作用。ILK可使Akt及糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase3,GSK3)磷酸化[13],Akt抑制上皮细胞凋亡,GSK3磷酸化后失活,失活后的GSK3激活β连接素、AP1及转录因子CREB,β连接素活化淋巴细胞增强因子使Snail水平增加[14],AP1可诱导MMP9的表达,降解小管基底膜[15]。ILK的生理学效应覆盖了整个EMT形成的步骤，ILK降低E钙黏蛋白的表达，促进纤连蛋白基质聚集，诱导MMP9表达及分泌，增强细胞的迁移及侵袭能力，上皮细胞发生EMT,迁移至间质。

　　RhoA是TGFβ的另一条信号转导通路，是与Smad平行的信号转导途径，通过ROCK转导信号。RhoA是小GTP酶家族的成员，它激活αSMA基因启动子,上调αSMA的表达[16]，诱导纤维合成,使肌球蛋白轻链磷酸化,增加上皮细胞的收缩能力,改变细胞形态,诱导发生EMT。

　　TGFβ还可使P38分裂原激活的蛋白激酶磷酸化,诱导αSMA表达。此外，糖基化终产物[8]、活性氧也可激活MAPK[17],引起EMT。

　　分化抑制因子1 (inhibitor of differentiation 1，Id1)在TGFβ的诱导下表达增加，它与螺旋环螺旋转录因子HEB(Hela Ebox binding factor)形成复合物，抑制HEB与Ebox结合，下调E钙黏蛋白的表达[18]。Id2、Id3与Id1的作用相反,TGFβ使它们表达减少[19]。

　　肾小管上皮细胞发生EMT时，细胞与细胞间、细胞与基质间连接发生改变。Snail是影响小管上皮细胞黏附性的重要信号转导因子。β连接素或磷酸化的Smad3激活淋巴增强因子，淋巴增强因子进入细胞核内诱导产生Snail[20]，Snail与E钙黏蛋白、claudin、occuludin的启动子区Eboxes连接，抑制它们的表达，改变细胞的黏附性[21] 。β连接素在生理状态下参与小管上皮细胞间的连接,当上皮细胞间的黏附完整性受损时,它被释放出来,参与信号转导[22]。

　　除了上述的信号转导通路外还有Ert1/2、Wnt和Notch，它们在转分化中的作用目前还不是太清楚。

　　4 研究

　　EMT形成机制的意义——逆转分化的可能性 由于EMT在肾脏间质纤维化形成中有重要作用,如何逆转分化成为目前关注的热点。骨成形蛋白7(bone morphogenic protein7,BMP7)及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF) 是目前认为有逆转分化功能的最为重要的两个因子。BMP7属于TGFβ超家族, BMP7能激活ALK3、ALK6Ⅰ型受体激酶,磷酸化后的Ⅰ型受体使Smad5磷酸化,Smad5拮抗Smad3的作用,抑制肾小管上皮细胞转分化[23]。BMP7在正常的小管上皮及足细胞表达，小管细胞损伤时, BMP7表达下降，利用外源性BMP7有助于保护肾功能。

　　HGF与cmet受体结合后使细胞表达SnoN，SnoN是Smad2的转录抑制因子，抑制Smad2向核转录,阻止TGFβ激活ILK,减少CTGF及MCP1表达,引起逆转分化[24]。过氧化物酶体增殖激活受体拮抗剂、视黄酸、1，25二羟维生素D3可增加HGF基因表达[25]。但有实验证实,小剂量的HGF会促进基质合成,其机制尚不明确。此外,Smads中Smad7与Smad2/3竞争与TGFβⅠ型受体结合，抑制EMT发生[26]。组蛋白脱酰基酶抑制剂可以通过诱导产生Id2及BMP7阻碍TGFβⅠ的致纤维化效应[27]。

　　另外有研究发现，细胞外的一类配体捕获蛋白(ligandtrap protein)通过调节TGFβ、BMP7等因子与受体结合的亲合力从而影响转分化的发生。对TGFβ起阴性调节作用的阴性捕获蛋白有核心蛋白多糖(decorin)、LAP、α2巨球蛋白等，BMP7的阴性捕获蛋白有noggin、chordin等。CTGF既是TGFβ的阳性捕获蛋白，又是BMP7的阴性捕获蛋白。KCP(a kielin/chordinlike protein) 是Lin等[28]最近发现的分子，是BMP7的阳性捕获蛋白，能下调纤维化。这类蛋白是近来转分化研究中令人欣喜的发现，为调节EMT提供了新的途径。

　　基于对EMT分子机制的认识,人们还在实验中运用现代分子生物学技术,阻断TGFβ及其下游信号转导通路,从而逆转EMT。有人用TGFβ的中和抗体、蛋白水解酶、核心蛋白聚糖、可溶性Ⅱ型受体来阻断TGFβ的效应,但难以达到稳定的效果[8]。本实验室用反义寡核甘酸下调TGFβ下游因子CTGF的表达,有较为显著的效果[29]。己酮可可碱(PTX)亦可下调CTGF,它可激活蛋白激酶A从而阻碍Smad3/4依赖的CTGF基因转录[30]。GSK3可减少细胞内Snail表达,抑制其对E钙黏蛋白的作用[31]。而运用Y27632阻断RhoROCK激活途径可抑制EMT的关键步骤[32]。也有人想通过阻断p38激活来控制EMT,但MAPK在纤维化中的作用比较复杂,如何控制其效应还有待研究。氨基胍是糖基化终产物的拮抗子,也有助于逆转EMT。

　　血管紧张素Ⅱ可以通过诱导TGFβ及CTGF表达引起EMT。故ACEi(angiotensin converting enzyme inhibitors)及ARB(angiotensin receptor type 1 blocker)也能下调EMT[8],该效应不依赖其降压作用。此外,慢性肾脏病的一般治疗对逆转分化也有一定的益处,如降血压、降脂、减少蛋白尿、戒烟等,抗炎药物及抗醛固酮药物对EMT亦有一定的调节作用。

　　5 总 结

　　随着近年来对EMT分子机制研究的进一步深入，人们对纤维化的传统认识正在受到挑战，逆转分化被认为可能成为未来抗纤维化治疗的重要策略，目前与此相关的研究方兴未艾。

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