辛伐他汀对冠心病患者内皮祖细胞增殖的影响及其机制初步探讨

作者:徐全胜,张家明,李宾公

作者单位：武汉市第一医院心内科，湖北 武汉 430030          【摘要】  目的：观察辛伐他汀对冠心病患者外周血内皮祖细胞（EPCs）增殖的影响并初步探讨其机制。方法：冠心病患者28例，随机分为辛伐他汀组和对照组，前者给予辛伐他汀40 mg/d口服，治疗前及治疗后2、4周抽取外周血，采用密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7 d后对贴壁的细胞进行分析。以激光共聚焦显微镜鉴定为FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ和Dil（一种亲脂性碳化青荧光染料）标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为EPCs。计数法比较二组EPCs数目，并对病人血浆低密度脂蛋白-胆固醇(LDL|C)水平和EPCs数进行相关分析。另取10例冠心病患者血培养EPCs，加入辛伐他汀、PI3K/Akt信号转导通路抑制剂Wortmannin后观察对其增殖的影响。结果：辛伐他汀组病人治疗后2周、4周外周血中EPCs明显上升（P<001），其变化与LDL|C变化无相关性(P>005)，体外实验辛伐他汀+Wortmannin组的血EPC数目较辛伐他汀组明显下降（P<001）。结论：辛伐他汀能刺激EPCs的增殖，这种作用能被Wortmannin阻断。故辛伐他汀作用可能与激活PI3K/Akt信号转导通路有关。

    【关键词】  辛伐他汀 干细胞 PI3K/Akt

    Effect and mechanism of simvastatin on the proliferation of endothelial progenitor cells/XU Quan|sheng, ZHANG Jia|ming,LI Bin|gong,WANG Zhao|hui,WANG Xiang//Chinese Journal of Cardiovascular Rehabilitation Medicine,2007，16（3）：271

    Abstract：Objective:To investigate the effect of simvastatin on the proliferation of endothelial progentior cells (EPCs) and possible mechanism.Methods:The 28 patients with coronary heart disease(CHD) were divided into two groups: simvastatin group and control groupThe former were treated with 40 mg of simvastatin per day for 4 weeks.Before and 2 weeks or 4 weeks after the statin therapy, mononuclear cells were isolated from blood of patients by density gradient centrifugation.Adherence cells were harvested after 7 days culture.EPCs were characterized as adherent cells with double positive for Dil|acLDL|uptake and ulex europaeus agglutinin(UEA) binding by direct fluorescent staining under a laser scanning confocal microscopeEPCs were counted and analyzed.In addition, Liner correlation was used to analyze the relationship between the numbers of EPCs and LDL|C levelsEPCs harvested from other 10 patients blood were incubated with or without simvastatin and Wortmannin, a specific inhibitor of PI3K.Then the proliferation of EPCs was investigated.Results:The number of EPCs significantly increased in subjects with simvastatin in 2 or 4 weeks（P<001）.In addition，the numbers of EPCs did not correlated with LDL|C levels before or after treatment(P>005).The number of EPCs decreased（P<001） after to add wortmannin in vitro experiment in simvastatin group.Conclusion:Simvastatin can stimulate the proliferation of EPCs and this effect may be inhibited by wortmannin.

    Author′s　address：Department of Cardiology of the First Hospital of Wuhan, Hubei，Wuhan，430022, China

    Key words：Simvastatin;Stem cells; PI3K/Akt 内皮祖细胞（EPCs）是一类能分化为血管内皮细胞的前体细胞。研究表明，EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且在出生后成体血管新生过程中也起了重要作用[1]，新生血管中25%的内皮细胞是由EPC直接分化而来的[2]。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的EPCs，参与维持血管壁的完整性，但冠心病（CHD）病人的外周血EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与CHD的危险因素呈相关性[3]，因而研究如何提高外周血中EPCs的数量、功能对于治疗CHD等缺血性疾病可能会提供一种新的思路。本实验旨在观察辛伐他汀在体内及体外对EPCs的影响，并对其机制作初步探讨。

    1 资料与方法

    11 主要材料与试剂淋巴细胞分离液（比重1077）购自上海生化试剂二厂，EGM-2-MV内皮细胞培养基购自Clonetic公司，胎牛血清购自GIBCO公司，人纤维连接蛋白购自Chemicon公司；异硫氰酸萤光素(FITC)标记的荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)均购自深圳晶美生物公司，辛伐他汀购自杭州默沙东公司、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKt）信号通路抑制剂Wortmannin购自sigma公司。

    12 研究对象以冠状动脉造影有≥1支的冠状动脉狭窄>50%为诊断CHD标准，选取28例非急性心肌梗塞的CHD病人，随机分为辛伐他汀组和对照组，每组14人，两组病人临床资料见表1。病人确诊后辛伐他汀组口服辛伐他汀，每日40 mg，其它治疗措施两组无差异。另取10例CHD病人外周血各10 ml，用于培养EPCs后进行体外实验。

    13 方法

    131 辛伐他汀对CHD病人外周血中EPCs数目的影响：每例病人在治疗前、治疗后2周、4周时分别取外周血10 ml，常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板。加入EGM-2-MV培养基及5%FCS于5%CO2培养箱中,37℃恒温培养。培养4 d后，用PBS洗脱非贴壁细胞,换液后于第7 d进行检查分析。贴壁细胞用Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择15个视野（×200）对EPCs计数。取其平均值换算成每mm2的细胞个数记录。表1 本组冠心病人一般情况

    132 辛伐他汀对CHD病人血清胆固醇的影响：辛伐他汀组病人在治疗前及治疗后4周分别测定其空腹血清中TC、LDL|C的含量。计算治疗前、治疗后LDL|C的差值，并与治疗前、治疗后培养计数所得EPC数值做单因素直线相关分析。

 133 辛伐他汀对培养的EPCs直接作用：10例CHD病人各抽取外周血10 ml按上述方法培养EPCs。培养7 d后对每份样本获得的贴壁细胞随机分3组，A组只加培养液为对照组，B组加入终浓度1μmol/L的辛伐他汀，C组加入终浓度1μmol/L的辛伐他汀及5nmol/L的Wortmannin。继续培养24 h后对贴壁细胞进行Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ荧光化学染色后在激光共聚焦显微镜下记数双阳性细胞并进行比较，方法同上。

    14 统计分析采用SAS 81 for windows统计软件进行数据处理。实验数据以均值±标准差(±s)表示，组间均数比较用方差分析及q检验，以P＜005为差异有显著性。

    2 结 果

    21 EPCs的鉴定及计数培养4 d后可见贴壁的单个核细胞，7 d后单个核细胞变为内皮样细胞，呈胞梭形。对贴壁细胞行荧光化学染色后，在激光共聚焦显微镜下观察，见>80%的细胞双染色阳性(图1)，说明这些细胞能内吞ac-LDL 和结合UEA-1，可被认为是正在分化的EPCs。对EPCs进行计数比较，可见治疗前两组病人外周血EPCs差异无显著性意义（P>005）,而治疗2周后辛伐他汀组病人EPCs明显多于治疗前（P<001）；4周后辛伐他汀组病人EPCs较治疗前进一步升高（P<001），但与治疗2周时比较差异无显著性意义（P>005）。对照组各时间点所测EPCs数目无明显变化(图2)。

     22 直线相关性分析 辛伐他汀组病人LDL|C与EPCs的相关系数:治疗前，r=0324（P=0311），治疗4周后，r=0227（P=0528），LDL|C的下降值与EPC的相关系数r=-0176（P=0626），提示辛伐他汀增加EPCs的功能与其降脂作用无相关性。

    23 体外11辛伐他汀对EPCs增殖影响见图3。 EPCs加药后继续培养24 h后，辛伐他汀组(B组)与对照组(A组)比较， EPCs增殖数目明显增加(P<001)；辛伐他汀+Wortmannin组(C组)与B组比较，细胞增殖数目明显减少(P<001)；C组与A组比较，差异无显著性意义(P>005)。注：与对照组比较△△P<001；与辛伐他汀组比较▲▲P<001。

    3 讨 论

　　内皮祖细胞（EPCs）是一群具有游走特征并能进一步增殖分化的幼稚内皮细胞,仅从形态特征上,不能把EPCs识别出来,目前主要依靠细胞表面的分子标记进行识别。它既可表达在成熟内皮细胞表面，如血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）、血管内皮细胞上特异的酪氨酸激酶型受体（Tie）1 、Tie2受体、VE2钙粘附素等，也可表达在某些造血干细胞表面，如CD34 、AC133等[4]。由于缺乏特有的表面标志,因而目前分离、纯化EPCs具有一定的难度，一般是综合各种标记加以确认。目前比较一致的看法是CD34+、KDR、AC133+（即CD133）细胞代表EPCs，以此作标记用流式细胞仪测得正常人外周血中EPCs数量为500～1 000个/ml，但CHD病人的数目更低，由于数目较少，因而直接测外周血中EPCs数量误差较大。本文参阅国外有关文献[5]，在同等条件下培养外周血EPCs，对培养后的EPCs进行计数，以反映原先血液中的EPCs数量。EPCs经贴壁法培养纯化，再经过目前国内外通用的Dil-acLDL、FITC-UEA-Ⅰ荧光化学染色从功能上对EPCs进行标记后，双染色阳性细胞就基本上代表了EPCs的群体[6]。本研究发现，CHD病人外周血中EPCs数量较正常人明显降低，而服用辛伐他汀后，EPCs数量明显上升，且这种作用与其降脂作用无相关性，这提示辛伐他汀升高EPCs的作用不依赖于其调脂作用。体外实验发现，辛伐他汀可直接作用于EPCs，促进其增殖，这种作用可被PI3K/AKt信号转导通道抑制剂Wortmannin阻断。PI3K为生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员,可受多种细胞因子和理化因素激活，Akt是位于PI3K下游的一个重要激酶，二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子，并且共同构成细胞对外应激反应过程中的促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。多种细胞的生存、凋亡信号通过激活PI3K/AKt信号途径进行传导。已有研究表明，他汀类药物是这一信号传导通路的激活剂。Wortmannin阻滞EPCs的增殖，提示辛伐他汀可能是通过这一信号转导通路起作用的。除了直接促进EPCs的增殖外，他汀类药物还能促进骨髓EPCs的动员与分化[7]，我们在以往的动物实验研究中也证实了这一点[8]，这也是应用辛伐他汀可以使外周血中EPCs上升的重要原因之一。总之，本研究发现，在体内和体外，应用辛伐他汀后都能促进EPCs的增殖，且这种作用与PI3K/Akt信号转导通路有关。

【参考文献】  [1]Murayama T, Tepper OM, Silver M, et alDetermination of bone marrow derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor|induced neovascularization in vivo［J］.Exp Hematol, 2002,30:967-972.

[2]Suzuki T, Nishida M， Futami S， et alNeoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humansA case report of a Tokaimura nuclear accident victim［J］.Cardiovasc Res， 2003，58 :487-492.

[3]Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et alCirculating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk［J］.N Engl J Med,2003,348:593-600.

[4]Rumpold H, Wolf D, koeck R, et alEndothelial progenitor cells: a source for therapeutic vasculogenesis［J］. J Cell Mol Med, 2004, 8:509-518.

[5]Shintani S, Murohara T, Ikeda H, et al Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction［J］.Circulation, 2001,103:2776-2779.

[6] Fan CL, Gao PJChe ZQ, et alTherapeutic neovascularization by autologous transplantation with expanded endothelial progenitor cells from peripheral blood into ischemic hind limbs［J］.Acta Pharmacol Sin，2005,26:1069-1075.

[7]Walter DH，Rittig K,Bahlmann FH，et alStatin therapy accelerates reendothe 2 lialization :a novel effect involving mobilization and incorporation of bone mar2 row2 derived endothelial progenitor cells[J].Circulation,2002,105:3017-3024.

8]李宾公，曾秋棠，晏凯利骨髓干细胞动员治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究［J］.中国急救医学，2005，25（4）：268-270.