阿托伐他汀对巨噬细胞胆固醇外流的影响

   【摘要】  通过研究阿托伐他汀对巨噬细胞的肝X受体（LXR）及其下游的一些目的基因的表达和胆固醇外流的影响，探讨他汀类药物对LXR信号系统的作用。方法 分离人外周血的单核细胞，并转化为巨噬细胞。在阿托伐他汀的作用下，观察巨噬细胞的载脂蛋白AⅠ(apoAⅠ)介导的胆固醇外流的变化和LXR以及其下游一些目的基因的mRNA表达。结果 阿托伐他汀显著影响巨噬细胞中一些涉及胆固醇代谢及炎症反应的基因的表达，同时apoAⅠ介导的胆固醇外流也受到影响，表现为增强胆固醇的外流。结论 巨噬细胞在阿托伐他汀的作用下，胆固醇外流增强，这种效应与阿托伐他汀上调LXR及其下游的影响胆固醇代谢的目的基因有关，同时，也抑制一些炎症反应的基因的表达。提示他汀类药物的治疗作用，与其影响巨噬细胞LXR信号途径有关，从而影响泡沫细胞的形成。

   【关键词】  阿托伐他汀 胆固醇外流 巨噬细胞 肝X受体

   Regulation of macrophage cholesterol efflux by atorvastatin    QIAN Zongjie1, ZENG Qiutang2, QIU Ling1, XIAO Chuanshi1.1.Department of Cardiology, Second Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Cardiology, Union Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

    Abstract：Objective  To investigate the effects of atorvastatin on the gene expression of liver X receptor alfa(LXRα) and its downstream signaling system and on the cholesterol efflux of human macrophages.   Methods  Human monocytes were isolated and were induced to transform to macrophages. ApoAI induced human monocytederived macrophage cholesterol efflux and gene expression of LXRα and its downstream signaling system were observed under the use of atorvastatin.   Results  Preincubation of human monocytederived macrophages with atorvastatin, dose dependently (12 μmol/L) stimulated cholesterol efflux induced by apoAI.Atorvastatin increased the gene expression of LXRα and its downstream signaling system.   Conclusions  The above mentioned mechanism can partly explain the potential therapeutic benefit of atorvastatin in the treatment of atherosclerosis.

    Key words：  Atorvastatin；  Cholesterol efflux；  Human monocytederived  macrophage；  Liver X receptor

      巨噬细胞在动脉壁转变为泡沫细胞是动脉粥样硬化病变的启动机制，现有的研究发现，巨噬细胞内肝X受体（liver X receptor，LXR）的活化，启动多种涉及细胞内介导胆固醇外流的基因，同时也影响许多的炎症基因的表达，正是在这两个方面的效应，LXR发挥其抗动脉粥样硬化作用[1]。

    他汀类的药物，其有效的调脂作用，降低冠心病（coronary artery disease，CAD）发生的危险性，已被广为接受。另外，很多的研究显示，他汀类的药物除了调脂之外，还具有其他对CAD有益的作用[2]。本研究试图通过观察他汀类药物对人巨噬细胞胆固醇外流以及LXR与LXR信号途径的一些分子表达的影响，来探讨他汀类药物对LXR的影响在冠心病发病中的作用。

　　1  材料和方法

    1.1  材料与试剂

    21例健康成人外周血液，提取外周血的单核细胞作为本研究的实验材料。Ficoll淋巴细胞分层液、2％台盼蓝染液、小牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、0.02%EDTA（购自武汉亚法生物公司），完全RPMI1640培养液（Gibco公司），[3H]胆固醇、载脂蛋白AI（apolipoproteinAⅠ，apoAⅠ）、TO901317（购自Sigma公司），佛波酯(phorbol 12myristate 13acetate,PMA)（购自Alexis Biochemicals公司），Trizol试剂（购自Promega公司），用于RTPCR的试剂和DNA标记DL2000（购自TaKaRa Biotrchology公司），阿托伐他汀（北京红惠生物制药股份公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  外周血单核细胞分离  抽取患者动脉血10 ml，采用Percoll（比重1.077）密度梯度离心法分离收集外周血单个核细胞。以1×107/ml细胞浓度加入6孔细胞培养板，每孔2 ml，置37℃，5% CO2贴壁培养2 h，收集贴壁的细胞，Giemsa染色纯度90%以上，2％台盼蓝染液染色示细胞活力95%以上。

    1．2.2  巨噬细胞的转化  按文献的方法[3]，将收集的单核细胞调整为3.0×106/ml,转入6孔培养板,在含有10%小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml的RPMI1640培养液，加3.2×10－7mol/L的PMA,5%CO2，37℃的培养箱中孵育24h。

    1．2.3  巨噬细胞的处理及胆固醇外流的测定  参照文献[4] 描述的方法，将巨噬细胞调整为3.0×106 ml的浓度，转入6孔细胞培养板，在含有10%小牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml的RPMI1640培养液中加0.2 μCi/L [3H]胆固醇共培养48 h，用PBS 液洗涤细胞。获得的巨噬细胞调整为3.0×106ml的浓度，转入6孔细胞培养板，在上述培养液中，在实验组加终浓度0、1、2 μmol/L的阿托伐他汀和同时加或不加2 μmol/L的TO901317，培养24 h（0 μmol/L的阿托伐他汀，即DMSO）。再用PBS 液洗涤细胞, 在无血清含10 μg/L apoA1新培养液中培育细胞12 h ,用闪烁计数法检测培养液和细胞的[3H]胆固醇。胆固醇流出用培养液中每分钟记数（CPM）除以总CPM , 再乘以100%来表示。

    1．2.4  逆转录聚合酶链反应  收集上述各组细胞。按Trizol 试剂盒说明书提取总RNA。取 各组细胞总RNA 2 μg 逆转录合成cDNA ,再取逆转录产物10 μl进行PCR 循环。94℃预变性5 min，PCR扩增34个循环（94℃变性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min）后，72℃再延伸10 min，然后4 ℃延伸5 min。PCR引物由武汉伯杰生物公司合成，LXRα：（上游）5′CTT CTG GAG ACA TCT CGG AGGT3′，（下游）5′CTG ATA GCA ATG AGC AAG GCA A3′；ABCA1：（上游）5′ATA AGC CCT CTA TAC ATA AAT GCC3′，（下游）5′ACA GCG TAA AGT GCT TGG AAT G3′；SREBP2：（上游）5′ATA GGT GGC AGG GCA GAA AC3′，（下游）5′AAT CAA GAC GCT ACA GCA ACT CA3′；CETP：（上游）5′AAG ATG CCC AAG ATC TCC TG3′，（下游）5′AAG CTC TGG AGG AAA TCC AC3′；PLTP：（上游）5′CTG CGA GAG GTG ATT GAG AAG A3′，（下游）5′CAG GCT ATG AAT GTG GGA AAA G3′；apoE：（上游）5′GCG GAT GGA GGA GAT GGG3′，（下游）5′AGG CAG GAG GCA CGG GGT3′；MMP9：（上游）5′CTT CCA GTA CCG AGA GAA AGC C3′，（下游）5′CAA AGG TGA GAA GAG AGG GCC3′；MIP1α：（上游）5′CGC CTG CTG CTT CAG CTA CAC3′，（下游）5′TGT GGA GGT CAC ACG CAT GTT3′；GAPDH：（上游）5′CCC ATG TTC GTC ATG GGT GT3′，（下游）5′TGG TCA TGA GTC CTT CCA CGA TA3′。反应结束后, 取反应产物10 μl 进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, UVP型凝胶图像分析系统摄图, 并分析各组目的基因及GAPGH 基因灰度值,以二者的比值代表各基因的表达量。

1.3  统计学处理

    在SAS 统计分析软件上分析各组数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，根据数据特征作方差分析和χ2检验及t检验。以P＜0. 05 有统计学意义。

2  结果

    2.1  阿托伐他汀对巨噬细胞胆固醇外流的影响

    由apoAⅠ介导的人外周血来源的巨噬细胞胆固醇外流[不加 TO901317 (10.43±0.27),加 TO901317 (15.47±1.25)]，阿托伐他汀增强胆固醇的外流，并呈剂量依赖性，2 μmol/L浓度的阿托伐他汀的效应(17.47±0.54)强于1 μmol/L浓度的阿托伐他汀(13.17±1.33) ( P＜0.05)。巨噬细胞在TO901317的作用下，更进一步影响阿托伐他汀的这种效应[2 μmol/L为(21.32±1.71)，1 μmol/L为(19.23±2.14) (均P＜0.05)]。

    2.2  阿托伐他汀对人外周血来源的巨噬细胞LXRα及下游基因mRNA表达的影响

    在阿托伐他汀的作用下，人外周单核细胞来源的巨噬细胞，涉及胆固醇外流的基因LXRα、三磷酸腺苷结合盒转移子家族A1(ATP binding cassette A1，ABCA1)、胆固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein,SREBP2)、磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein,PLTP)、胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）的mRNA的表达均有上调趋势。涉及炎症反应的基因基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP9）、巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein1α，MIP1α）的mRNA的表达水平则降低。并且在加TO901317的作用下，这种效应更趋明显（表1，图1）。表1  阿托伐他汀对巨噬细胞LXRα及其目的基因的表达注：相同atorvastatin浓度组间，与未加TO901317组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与未加atorvastatin(DMSO)组比较，cP＜0.05，dP＜0.01；与1μmol/L atorvastatin组比较eP＜0.05，fP＜0.01

    3  讨论

    动脉粥样化形成的启动首先是循环中的单核细胞进入血管内皮下间隙并分化为巨噬细胞，当氧化型或经修饰的低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein，LDL）存在时，这些巨噬细胞就积聚胆固醇酯而转化为泡沫细胞。巨噬细胞的致动脉粥样硬化作用，是通过积集氧化低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，oxLDL)和产生炎症介质、细胞因子以及细胞外基质降解酶来实现[5]。

    LXR属核受体超家族的配体激活的转录因子，其成员LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）。LXRα主要在肝、肾脏、脾、肠等组织以及巨噬细胞上表达，而LXRβ在几乎所有组织细胞上表达。LXR与视黄醛核受体（retinoic acid receptor，RXR）以杂二聚体形式存在，胆固醇的一些代谢产物是其内源的激活配体，如羟基固醇24(S),25环氧胆固醇、24(S) 羟基胆固醇和22(R)羟基胆固醇，人工合成的GW3965、TO901317是其特异的激活剂。另一方面，多不饱和酸、亚油酸和纤维酯类是LXR的拮抗剂。LXR通过直接结合在靶基因的DR4（direct repeat four）序列位点，即LXR反应元件(LXR response element,LXRE)，调节靶基因的表达，同其他的核受体超家族的成员一样，是一种转录因子，通过与共刺激因子或共抑制因子的相互作用来发挥刺激或抑制目的基因的表达。近几年来的研究表明，许多涉及脂代谢平衡、炎症及免疫反应的基因均接受LXR的调节[3]。巨噬细胞中，LXR在内源性配体激活后，LXR作用于靶基因DR4序列，如ATP结合盒转移子家族(ATP binding cassette，ABC)，SREBP，脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)，PLTP，载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)及载脂蛋白族ApoCI, ApoCIV和ApoCII，CETP等，以及这些靶基因对其下游的基因的作用，调节巨噬细胞的脂代谢平衡[3]。同时激活的LXR抑制一些致炎基因的表达,如可诱导一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧化酶2（cycloxygenase2，COX2）、白介素1（interleukin1，IL1）和白介素6（interleukin6，IL6），MMP9及细胞因子单核细胞趋化蛋白1、3（monocyte chemoattractant protein1、3， MCP1、MCP3）,和MIP1α、干扰素诱生蛋白10（ interferon inducible protein10，IP10）等[3,5]。

    在巨噬细胞内,通过协同调节介导胆固醇摄入、储积、细胞内合成和外流，来维持胆固醇平衡，当调节这些功能的信号出现故障，可能导致泡沫细胞的形成[9]。羟甲基戊二酰辅酶A（3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A ，HMGCoA) 还原酶是胆固醇合成的限速酶，目前，有很多的研究揭示LXR与HMGCoA还原酶之间的相互作用，调节巨噬细胞内的胆固醇代谢平衡 [6，7]。

    有许多的研究者研究了不同实验条件和不同细胞系，发现他汀类药物对巨噬细胞胆固醇外流的影响存在不一致性[810]。Argmann等[8]的研究发现，应用阿托伐他汀，可增强LXR的活性、增强ABCA1的表达，促进胆固醇的外流，并且他汀类药物诱导的ABCA1上调和胆固醇外流，有赖于LXR的活化，因为LXR拮抗剂可完全地对消这种效应。而新近Zanotti等[10]的研究则显示，他汀抑制ABCA1的表达和胆固醇的外流。发现他汀类药物降低经cptcAMP刺激处理的巨噬细胞的胆固醇和磷脂外流，这种效应与ABCA1 mRNA和蛋白降低是一致的。另外，不是由cptcAMP的刺激，而是在22双羟胆固醇/9顺维甲酸或胆固醇负荷的刺激下的ABCA1上调，他汀类药物并不影响巨噬细胞的胆固醇和磷脂的外流。并且，他汀类药物抑制cptcAMP诱导的胆固醇外流，在加甲羟戊酸、双羟胆固醇和胆固醇时，可以逆转这种效应。所以，他汀类药物的这种作用可能与其抑制胆固醇衍生物生成有关。在LXR基因缺陷来源的小鼠巨噬细胞，cptcAMP诱导的胆固醇外流，他汀类药物则对其没有影响，这进一步说明，他汀类药物对ABCA1表达和胆固醇外流的抑制，依赖于固醇激活的LXR途径。但是，这个结论与Argmann[5]等的结论存在不一致，尽管在实验材料和方法上两者有所不同[8，10]。对于这一点，Zanotti等[10]的解释是，与甲羟戊酸衍生物对ABCA1活性的双相效应有关。他汀类药物诱导的作为强效LXRα激动剂，24,25环氧胆固醇的消耗，导致了LXR途径的ABCA1的活化。在另一方面，他汀类药物导致的甲羟戊酸合成的类异戊二烯产物消耗，致使ABCA1阻抑途径的抑制。所以他汀类药物对LXR途径的作用，其最终的效应是不清楚的，可能依赖于细胞内甲羟戊酸途径的类异戊二烯和非类异戊二烯的平衡。

在本研究所处的实验条件下，发现阿托伐他汀类药物一方面可以上调LXRα和一些调节细胞内胆固醇代谢的基因，另一方面也抑制一些炎症基因的表达，故既可以有利于胆固醇细胞外的转移，从而减少泡沫细胞的形成，又可抑制LXR介导的炎症，发挥抗动脉粥样硬化的作用。但是，要阐明他汀类药物对LXR信号系统的作用，还需要进一步的研究。 

【参考文献】  ［1］Ricote M,Valledor AF,Glass CK. Decoding transcriptional programs regulated by PPARs and LXRs in the macrophage: effects on lipid homeostasis, inflammation, and atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24:230239.

［2］Castilho LN,Chamberland A,Boulet L,et al.Effect of atorvastatin on ApoE and ApocI synthesis and secretion by THP1 macrophages[J]. J Cardiovasc Pharmacol,2003,42:251257.

［3］Suzuki S, Tomoko NM, Tamehiro N,et al. Verapamil increases the apolipoproteinmediated release of cellular cholesterol by induction of ABCA1 expression via liver X receptorindependent mechanism[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24:519525.

［4］Lin GR,Bornfeldt KE. Cyclic AMPspecific phosphodiesterase 4 inhibitors promote ABCA1 expression and cholesterol efflux[J].Biochem Biophys Res Commun,2002, 290: 663669 .

［5］Lusis AJ. Atherosclerosis[J]. Nature, 2000,407:233 241.

［6］von Eckardstein A, Nofer JR, Assmann G. High density lipoproteins and arteriosclerosis. Role of cholesterol efflux and reverse cholesterol transport[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21:327.

［7］Sever N, Yang T, Brown MS,et al.Accelerated degradation of HMG CoA reductase mediated by binding of insig1 to its sterolsensing domain[J]. Mol Cell,2003,11:2533.

［8］Argmann CA,Edwards JY,Sawyez CG,et al. Regulation of macrophage cholesterol efflux through hydroxymethylglutarylCoA reductase inhibition[J]. J Biol Chem,2005,280:2221222221.

［9］Cheung MC,Wolfbauer G,Kennedy H,et al. Plasma phospholipid transfer protein activity in patients with low HDL and cardiovascular disease treated with simvastatin and niacin[J]. Biochem Biophys Acta，2001，1537:117124.

［10］Zanotti I,Poti F,Favari E,et al. Pitavastatin effect on ATP binding cassette a1mediated lipid efflux from macrophages. Evidence for LXRdependent and LXRindependent mechanisms of activation by cAMP[J]. J Pharmacol Exp Ther,2006,317: 395401.