双羟基黄酮醇防治心肌梗死后再灌注损伤的

    【摘要】  评价双羟基黄酮醇（DiOHF）对缺血再灌注（I/R）损伤心肌释放的氧自由基（OFR）的清除作用和对心肌再灌注损伤的保护效果。方法 山羊随机分为4组（n=8）： 对照组（CON）、 缺血预适应组（IPC）、 DiOHF治疗组（2 mg/kg，iv）和赋形剂治疗组（VEH）。心肌I/R通过阻断第二对角支分叉以后的左前降支1 h和复通3 h来实现。结果 用10－8～10－4 mol/L的DiOHF在体外孵育VEH组的I/R损伤心肌具有浓度依赖地抑制OFR释放的效应，来自DiOHF组的I/R损伤心肌释放OFR的能力也显著下降。心肌梗死面积在DiOHF组 [（47±6）%]和IPC组 [（44±4）%]分别较VEH组的 [（74±3）%]与CON组 [（76±5）%]有明显的缩小。与VEH组相比，DiOHF组显著减少了心肌酶的释放和中性粒细胞在缺血区心肌的浸润。结论 DiOHF在山羊心肌梗死模型中显著减少了I/R损伤心肌OFR的释放，缩减了心肌梗死面积和中性粒细胞浸润的程度，且DiOHF对I/R损伤心肌的保护效果与缺血预适应具有可比性。

    【关键词】  类黄酮 抗氧化剂 心肌梗死 再灌注损伤

    Effects of 3’, 4’dihydroxyflavonol on ischemia/reperfusion injury in an ovine myocardial infarction model   XU Bin, ZHOU Tianyi, CUI Shitao, ZHUANG Yugang, WANG Liangxu, WANG Sheng. Division of Cardiovascular Surgery, Shanghai 10th People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China

    Abstract：Objective  To investigate the superoxide scavenging action of 3’, 4’dihydroxyflavonol (DiOHF) and its effects on myocardial ischemia and reperfusion (I/R) injury in an ovine myocardial infarction (MI) model.  Methods  Thirtytwo Goats were randomly divided into four groups (each group had 8 goats): control group (received 1h of ischemia and then 3 hours of perfusion), ischemic preconditioning (IPC) group (compared with control group, 2 cycles of 5 minutes’ ischemia plus 5 minutes’ reperfusion were given before 1h of ischemia and 3 h of reperfusion), DiOHF group (compared with control group, 2 mg/kg of DiOHF was injected by vein immediately before reperfusion) and vehicle group (compared with control group, 1 ml DMSO and 4 ml polyethyleneglycol were injected by vein immediately before reperfusion). After the animals were anesthetized, ischemia reperfusion was done by occluding the left anterior descending coronary artery at the point distal to the second diagonal branch for 1h and reopening for 3 h. To observe the superoxide scavenging action of DiOHF in vitro, myocardium collected from the vehicle group was incubated with DiOHF in different concentrations (108104 mol/L).   Results  Infarct size was markedly reduced in DiOHF group and IPC group compared with vehicle group and control group [(47 6)%, (44±4)% vs. (74±3)%, (76±5)%)]. DiOHF group also had decreased release of myocardial enzymes and less neutrophil infiltration in the ischemic myocardium compared with vehicle group. In vitro experiment showed that DiOHF inhibited superoxide production in a concentrationdependent manner.  Conclusions  DiOHF effectively attenuated superoxide production in the postI/R myocardium both in vitro and in vivo, provided marked protection against myocardial I/R injury in an ovine MI model. The extent of I/R injury protection exerted by DiOHF is comparable to that of IPC.

    Key words：  Flavonoids;  Antioxidants;  Myocardial infarction;  Reperfusion injury

    氧化应激是导致心肌缺血再灌注损伤的关键原因之一，但当前抗氧化剂治疗心肌缺血再灌注损伤的效果并不令人满意，其中一个主要的障碍是外源性抗氧化酶无法进入细胞内清除氧自由基（oxygen free radicals，OFR）[1]。类黄酮是一类可由多种植物合成的多酚化合物，其生物学特性是抗氧化作用，且类黄酮是脂溶性物质，可以透过细胞膜达到清除细胞内OFR的目的[2]。然而人们对类黄酮在生物体内的抗氧化活性少有研究，对心肌缺血再灌注损伤潜在的治疗作用亦未获得足够的重视。为此，我们观察了在体外和体内应用人工合成类黄酮双羟基黄酮醇（3’, 4’dihydroxyflavonol，DiOHF）对缺血再灌注心肌释放OFR的影响，并评价DiOHF对致死性心肌缺血再灌注损伤的防治效果。

1  材料和方法

    1.1  心肌梗死模型的建立

    成年山羊（30～48 kg）经硫贲妥钠（15 mg/kg）静脉诱导后气管插管，并用异氟醚（1.5%～2.0%）维持全身麻醉。左颈内静脉置管作为静脉用药通路，右面动脉插管用于血压监测和抽取血样。心脏经左第四肋间切口显露，先在第二对角支分叉的近端游离左前降支（LAD），放置超声流量计（美国Transonic公司）监测LAD血流量，并在其远端用10号丝线制成血管阻断器，然后把一个导管型的微型压力计（Mikrotip, 美国Millar公司）通过左心房置入左心室用于监测左心室内压。外科操作完成15 min后，通过收紧血管阻断器阻断血管1 h，然后重新开放3 h来实现心肌梗死和再灌注。

    1.2  实验分组

    实验动物随机分为对照组 (CON)、缺血预适应组 (IPC)、赋形剂治疗组 (VEH) 和DiOHF治疗组（DiOHF）共4组（各8只）。CON组除接受1 h缺血和3 h再灌注外无任何处理；IPC组通过两个循环的5 min缺血和5 min再灌注来实现，余同CON组；VEH 组在再灌注前1 min静脉注射1 ml 二甲亚砜(DMSO)和4 ml 聚乙二醇，余同CON组；DiOHF组则把赋形剂改为2 mg/kg的DiOHF（该剂量的DiOHF可使其血浆浓度达到0.2  mmol/L，接近在体外具有最大抗氧化效应的浓度，余同VEH 组。实验过程中实时监测动脉压和左心室内压，实验结束时取心脏用于心肌梗死面积、OFR、中性粒细胞浸润及生化指标等的测定。

 1.3  检测指标

    1.3.1  血流动力学  平均动脉压通过记录的动脉压曲线计算，心率（HR）、左室收缩末期压（LVESP）、左室舒张末期压（LVEDP和dP/dtmax由左室内压曲线计算。压力传感器在每次实验前均校零，并在血流动力学相对稳定时记录数据。

    1.3.2  心肌梗死面积  心肌缺血区域和梗死面积的大小通过伊文思蓝（Evan’s blue）和TTC的双重染色来测定[3]。实验动物在实验结束用过量的异戊巴比妥处死，LAD阻断处远端和左心房分别插管，两者分别同步加压注射肝素水和伊文思蓝以显示心肌的缺血区域，然后心脏被切成厚约1 cm 的横断组织块，在1％ TTC溶液中常温孵育20 min后显示梗死区域。结果用体积百分比表示。LV、AR和IS分别代表左室心肌、缺血心肌和梗死心肌体积。

    1.3.3  氧自由基释放  为评价DiOHF在体外的抗氧化作用，来自VEH组缺血区心肌的标本在一系列浓度的DiOHF（104～108  mol/L）中孵育后测定OFR的含量；为评估DiOHF在体内的清除OFR的作用，我们测定了来自DiOHF和VEH组的正常灌注和缺血区域的心肌标本中OFR的含量。心肌OFR的释放用光泽精化学发光法测定[4]。

    1.3.4  心肌酶  乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CK）的活性用CX5 Beckman自动生化分析仪测定。

    1.3.5  中性粒细胞浸润  中性粒细胞心肌细胞浸润程度参照Ambrosio的方法测定[5]。心肌组织用福尔马林固定后包埋切片，经HE染色后在400倍的光镜下随机选取5个视野分别统计中性粒细胞数量，取平均数表示心肌中性粒细胞浸润的程度。

    1.4  统计学处理

    所有计量资料均以均数±标准差（±s）表示，心肌梗死面积和OFR含量用单因素方差分析检验，其他各组资料均采用Bonferroni配对检验的单因素方差分析检验，P＜0.05表示有统计学差异。

2  结果

    2.1  动物死亡率

    本研究共使用了32只羊，CON组有4只在再灌注早期因不可逆性心室颤动而死亡，死亡率为50％，VEH组也有3只死于再灌注早期，死亡率37.5％。但在IPC组只有1只死亡，死亡率12.5％，而DiOHF组无1死亡，死亡率为0％。

    2.2  血流动力学

    LAD远段的阻断造成的缺血再灌注损伤对平均动脉压（MAP）、LVESP、LVEDP和dP/dtmax均无明显影响，HR虽在缺血期无变化，但在再灌注后明显加快，且与相应的对照组相比，IPC和DiOHF组HR加快的程度较低（P＜0.05，表1）。表1  IPC、VEH及DiOHF对实验动物血流动力学的影响注：与CON比较a P＜0.05；与VEH比较，b P＜0.05

    2.3  心肌梗死面积的影响

    心肌缺血区域的大小在各组具有可比性，但与各自的对照组比较，IPC和DiOHF组显著地缩小了心肌梗死的面积（P＜0.05，表2）。表2  各组心肌梗死面积注：    LV，AR和IS分别代表“左室心肌体积”，“缺血心肌体积”和“梗死心肌体积”。与CON比较， aP＜0.05；与VEH比较， bP＜0.05

    2.4  对氧自由基释放的影响

    在VEH组，缺血再灌注损伤心肌OFR的释放量较正常灌注心肌显著增加，在体外用不同浓度的DiOHF孵育的心肌则有DiOHF浓度依赖的OFR释放减少，且在体内应用DiOHF也能显著减少缺血再灌注损伤心肌OFR的释放量。

    2.5  心肌酶活性的改变

    缺血再灌注损伤后，CON和VEH组的LDH和CK活性显著增加，但IPC和DiOHF组显著地降低了LDH和CK活性增加的程度（表3）。

    2.6  中性粒细胞浸润

    在VEH组，缺血再灌注损伤心肌中性粒细胞浸润的程度〔（126.7±16.75） PMN/视野，PMN代表中性粒细胞数）〕较正常灌注心肌〔（5.64 ± 2.58） PMN/视野〕高20余倍， DiOHF治疗虽然对正常灌注心肌〔（6.21 ± 2.81） PMN/视野〕无影响，但显著降低了中性粒细胞在缺血区心肌浸润的程度（49.4 ± 12.61） PMN/视野，P＜0.05）。3  讨论

    类黄酮又称植物雌激素，由于在流行病学研究中发现对动脉粥样硬化和冠心病的预防作用而倍受关注，并被证实具有抗氧化作用。以往的研究表明，类黄酮的抗氧化效应与其化学结构密切相关。有表3  各组心肌酶活性的改变注：与CON比较， aP＜0.05，与VEH比较， bP＜0.05

    研究发现B环上的儿茶酚基团和C 环上具有4号位含氧基团的2、3位的双键结构是类黄酮抗氧化活性的决定因素；随后的研究又证明在C3、C3’及C4’上自由羟基能进一步增强其抗氧化活性[6]。本研究所用的双羟基黄酮醇就是基于上述的化学结构与生物学活性的关系而人工合成，旨在优化其抗氧化活性。尽管类黄酮在体外的抗氧化作用已得到充分的验证，在生物体内的抗氧化活性至今不明。本研究发现DiOHF不但在体外能够以浓度依赖的方式减少缺血再灌注心肌OFR的释放，而且在体内应用也能显著减少缺血区心肌OFR的释放量，提示DiOHF可能对心肌缺血再灌注损伤具有潜在的治疗作用。

    迄今为止，人们对类黄酮防治心肌缺血再灌注损伤的研究甚少。类黄酮曾被报道能够阻抑离体心脏的缺血性损伤，但这些研究均不用血液灌注，忽视了中性粒细胞在再灌注损伤中的重要作用[7]。此外，在这些研究中类黄酮通常在缺血前应用，而非再灌注前，这对于心肌梗死后再灌注损伤的防治而言是不现实的[7]。我们的研究表明，在心肌再灌注前静脉应用DiOHF能够显著缩小心肌梗死面积，并减少再灌注损伤，使动物死亡率、心肌酶释放及中性粒细胞在缺血区心肌的浸润程度等均显著下降。更为惊奇的是，DiOHF的心肌保护效应与缺血预适应具有可比性。因此，DiOHF具有成为溶栓、经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植术等的辅助治疗措施的潜力。

    本实验中，DiOHF能够缩减心肌梗死面积约40％，但心肌缺血区域只有整个心脏体积的20%左右。由于侧支循环是影响心肌梗死面积的重要因素，过小的缺血面积可能会影响心肌梗死面积大小的评判。但是，山羊不同于狗、大鼠等常用实验动物，山羊心脏在冠状动脉阻断后不会形成侧支循环的事实已被充分验证[8]；我们的实验结果也表明有超过70％的心肌缺血区域发生了心肌坏死，远高于具有侧支循环的实验动物（40％左右）。因此本研究所用的心肌缺血区域偏小而影响心肌梗死面积评判的可能性不大，且其他检测指标，如动物死亡率、心肌酶释放等也提示DiOHF能够减少心肌缺血再灌注损伤。

我们的研究还发现，DiOHF显著降低了缺血区心肌中性粒细胞的浸润程度。众所周知，中性粒细胞的黏附和聚集不但能够通过释放大量的OFR和各种蛋白溶酶而直接介导组织损伤，而且能够通过损伤血管内皮和造成机械梗阻而导致“无复流损伤”的发生和发展[9]。因而DiOHF对中性粒细胞浸润的抑制作用可能是DiOHF阻抑心肌缺血再灌注损伤另一重要机制，但DiOHF能否逆转心肌梗死后内皮功能不全，并缓解“无复流损伤”有待进一步的研究证实。参考文献：

【参考文献】  ［1］Ferdinandy P, Schulz R. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischemiareperfusion injury and preconditioning [J]. Br J Pharmacol, 2003, 138: 532543.

［2］Choi JS, Chung HY, Kang SS, et al. The structureactivity relationship of flavonoids as scavengers of peroxynitrite [J]. Phytother Res, 2002, 16: 232235.

［3］Ling H, Lou Y, Wu H, et al. Total flavones from Elsholtzia blanda reduce infarct size and improve heart function during acute myocardial infarction by inhibiting myocardial apoptosis in canines [J]. Acta Cardiol, 2005, 60: 295301.

［4］Paravicini TM, Gulluyan LM, Dusting GJ, et al. Increased NADPH oxidase activity, gp91phox expression, and endotheliumdependent vasorelaxation during neointima formation in rabbits [J]. Circ Res, 2002, 91: 5461.

［5］Ambrosio G, Tritto I. Reperfusion injury: experimental evidence and clinical implications [J]. Am Heart J, 1999, 138: S6975.

［6］Burda S, Oleszek W. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids [J]. J Agri Food Chem, 2001, 49: 27742779.

［7］Pataki T, Bak I, Kovacs P, et al. Grape seed proanthocyanidins improved cardiac recovery during reperfusion after ischemia in isolated rat hearts [J]. Am J Clin Nutr, 2002, 75:894899.

［8］Markovitz LJ, Savage EB, Ratcliffe MB, et al. Large animal model of left ventricular aneurysm [J]. Ann Thorac Surg, 1989, 48: 838845.

［9］Baxter GF. The neutrophil as a mediator of myocardial ischemiareperfusion injury: time to move on [J]. Basic Res Cardiol, 2002, 97:268275.