云南省EV71的分离鉴定和生物学特性分析

　　肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，基因分型将其分为A,B和C三个基因型，其中B型和C型又可进一步分为B1一BS和C1一CS'-'}oEV71感染常引起手足口病(hand-foot-mouthdisease,HFMD)}z}，主要发生在5岁以下儿童，少数病例可并发脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎等，可导致死亡。自1997年以来，EV71在亚太地区流行[4-6]0自2008年，该病在我国发生大流行，已成为我国现阶段重大的公共卫生问题之一。2009年，云南省共报告手足口病巧062例，其中重症302例，死亡13例，发病率为33.1543/10万，死亡率为0.02886/10万。迄今，尚无治疗EV71感染患者的特效药物，疫苗是预防手足口病的最有效措施。　　本研究对EV71的流行株进行分析，在Vero细胞上的适应性，以及病毒的抗原性和交叉保护试验进行研究，旨在能为疫苗的研制提供参考。　　材料与方法　　1.1标本采集根据卫生部《手足口病预防控制指南(2009版)》的要求，所有重症和死亡病例均需采样。此外，以县(区)为单位，每月最少需采集5例首次就诊的普通病例标本;采自7省(其中包括昆明市、普洱市、楚雄州、曲靖市、红河州、临沧市、昭通市)临床诊断为手足口病患儿的2份疤疹液、7份咽拭子和1份粪便标本采样患者均为轻症，结局为痊愈。确诊方法为RT-PCR，分离细胞为RD,HEP。　　1.2标本的实验室检测EV71肠道病毒分离，RT-FCR试验方法均按卫生部《手足口病预防控制指南(2009版)》中《手足口病标本采集及检测技术方案》进行。　　1.3VP1基因测序将8株病毒标本委托中国疾病预防控制中心进行测序，应用Mega软件对所得序列进行校正处理，与GenBank登陆序列进行比对，并构建基因亲缘性关系树。　　1.4病毒滴度和抗原含量测定按照《手足口病预防控制指南(2009版)》和文献所述的方法分别进行病毒滴度和抗原含量测定1.5动物免疫将分离到的8株病毒接种于生长成单层的Ver。细胞上，病变达到75%以上进行收获。对收获液经560C30min灭活后，测定抗原含量。用100U/剂(北京科兴生物制品有限公司标定)的收获液腹腔免疫ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，采用0d,14d2针免疫。第0d,14d,28d采血。4℃条件下离心，获得血清。　　1.6中和试验采用微量板细胞病变法检测中和抗体效价〔7.RJ。血清样本按2倍系列稀释法进行稀释，56℃水浴灭活30min。血清稀释后分别与100CCID5。病毒等体积混合，于96孔板中置37qCC0,培养箱中中和2h，加人Ver。细胞悬液，细胞浓度为2x105个/ml。置37cCCOZ培养箱中培养7d,显微镜下观察细胞病变，以能抑制50%细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和效价。试验设立细胞对照、血清对照和病毒对照，同时设立回滴(回滴结果在32一320CCIDSO/0.05ml时，试验成立)。检测结果以1:8判断为中和抗体阳性。　　1.7交叉保护试验将8个病毒株免疫后血清分别与A基因型、B3基因型,C4基因型病毒进行中和试验。将C4基因型毒株免疫血清分别对8个病毒株进行中和试验，C4基因型病毒来自北京科兴生物制品有限公司。　　2结果　　2.1检测结果实验室通过RT-PCR检测，8份标本结果均为EV71。使用Ver。细胞培养中引起特殊肠道病毒致细胞病变效应，表现为细胞圆缩、分散、胞质内颗粒增加，最后细胞自瓶壁脱落。8份标本在Ver。细胞中产生明显病变，对其进行后续试验。　　2.2基因测序病毒滴度:8株病毒在Ver。细胞中均可有效增值，但增值水平略有不同。除1株(299")小于5.OLgCCIDSO/ml以外，其他7株均>5.SSLgCCIDSO/ml。抗原含量:8株病毒经Vero细胞传代后均能监测到抗原，抗原含量均能达到100U/ml以上。　　2.3同源性对8个标本进行VP1基因测序，与GenBank登录序列进行比对，确定其中7株为C4基因型,1株为A基因型(280#)，见图1。对8株病毒进行VP1区全长基因特征分析。所测8株病毒的VP1编码区全基因nt序列均为891个nt，编码297个氨基(aminoacid,as)，和基因数据库(GenBank)中的相关序列比较，证实全部为EV71。与原型株BrCr的核营酸同源性在81.6%一98.5%,氨基酸同源性在93.9%一96.6%010-YN-CHN-2009(280#)株与原型株BrC:的核昔酸同源性为98.5%，和同为A型的安徽省六安和湖北2008年EV71分离株的同源性在97.9%一99.3%。其余7株毒株nt序列之间同源性在94.6%}99.9%，和同为C4a亚型的安徽省阜阳和北京市2008年EV71分离株的同源性在95.1%一98.3%，和Cob亚型的2004年上海市分离株同源性在92.6%一93.3%，与原型株BrCr的核昔酸同源性在81.6%一83.1%}7株与近年来我国EV71主要流行株C4a基因型聚在一起，属于C4a基因型。而10-YN-CHN-2009株与原型株BrCr聚在一起，属于A基因型。基因分型与上述同源性比较结果相符。　　2.4交叉保护结果由表1得知，云南8株病毒免疫血清对A及C4基因型有较好的交叉保护效果;对B3基因型保护效果不理想。如果把C4基因型血清对云南8株病毒的中和效价按高低顺序分为4个区间:>1:10000,1:1000一1:10000,1:1001:1000,<1:100。分组后结果显示，C4基因型免疫血清对云南8株病毒的中和抗体结果>1:10000的为3个，占38%;>1:1000的为5个，占63%;<1:100的为7个，占88%。　　3结论　　分离的8株病毒均为EV71，对VP1基因片段进行测定，测序结果表明，7株病毒为C4基因型，与从1999-2008年分离自深圳、上海、重庆、山东临沂、安徽阜阳及近几年流行株同属一个基因亚型。Ver0。细胞系是WHO推荐用于疫苗生产的良好的细胞，它具有来源方便、遗传背景清楚、无潜在致肿瘤性等优点，适合我国疫苗生产的实际需要。分离得到的8株病毒滴度可达到较高水平(7株>5.55LgCCIDS}/ml)，表明此次云南分离的病毒易于在Vero细胞中进行培养，有较强的细胞适应性。病毒在Ver。细胞中培养1代后抗原含量均可达到100U/ml，推测继续传代后可达到较高水平。　　综上所述，分离到的8株病毒在Ver。细胞中培养有很好的适应性。由于来自不同机体的EV71毒株增值代次和面对选择压力等不同，导致不同EV71的病毒滴度和抗原含量可能存在差别，那么筛选保护谱广、保护程度高的毒株制备疫苗尤为必要，与文献报道一致四。　　云南8株病毒免疫血清对于B3基因型只有3株病毒免疫血清表现出保护作用，保护效果不理想。而对于A和C4基因型均有较强的交叉保护能力(血清中和效价>1:8即具有保护能力),8株病毒免疫血清中和效价均>1:16，有3株可高达1:10000以上，此8株病毒免疫血清交叉保护效果明显。　　4参考文献　　Huang WP,Lin TL,Kuo CY. The circulation of subgenogroups B5 and C5 of enterovirus 71 in Taiwan from 2006to 2007[J].{H}Virus Research,2008.206-212.　　Solomon T,Lewthwaite P,Perera D. Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71[J].{H}LANCET INFECTIOUS DISEASES,2010.778-790.　　贾卉,蔡芳,高强. EV71抗原ELISA定量检验方法的建立[J].{H}中国生物制品学杂志,2010,(1):87-90.　　MeMinn P,Lindsay K,Pemra D. Phylogenetic analysis of entemvirus 71 strains isolated during linked epidemics in Malaysia,Singapore and Western Australia[J].{H}Journal of Virology,2001.7732-7738.　　Cardosa M J,Perera D,Brown B A. Molecular epidemiology of human enterovirns 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VPI and VP4 genes[J].{H}EMERGING INFECTIOUS DISEASES,2003.461-468.　　Chen K T,Chang H L,Wang ST. Epidemiologic features of hand-foot-mouth disease and herpangina caused by enterovirus 71 in Taiwan,1998-2005[J].{H}PEDIATRICS,2007.e244-e252.　　Grandien M,Fosgren M,Ehrnet A. Enterovirua[A].Washing-ton,DC:American Public Health Association,1995.279-298.　　Yin-Murphy M,Tan KL,Lim GN. Polivorirus neutralizing antibody in infants and cord blood[J].{H}Annals of the Academy of Medicine Singapore,1993.281-285.