重组人β防御素3对BEAS-2B细胞IL-17A和IL-22表达的影响
发表时间：2014-10-17 浏览次数：1351次
上皮细胞在固有免疫应答和适应性免疫应答中起着重要作用。IL-17A和IL-22主要由Th17细胞分泌，人a防御素3(humanbeta-defensin-3,hBD-3)是一种具有趋化和免疫调节性能的抗微生物肤，它可以通过TLR1/2激活抗原提呈细胞将豁膜固有免疫和适应性免疫联系起来川。 通过研究hBD-3对BEAS-2B细胞IL-17A和IL-22表达的影响，阐明hBD-3对IL-17A-IL-22轴自身平衡机制的影响，并探讨其在慢性鼻窦炎发病机制中的重要性。 1材料与方法 1.1主要试剂重组人a防御素3(美国Peprotech公司);人IL-17A,IL-22ELISA试剂盒(eBioscience公司);BEGM培养基(美国Lonza公司);SuperscriptllReverseTranscriptase(美国Invitrogen公司);SYBRPremixDimerEraser试剂盒(日本TaKaRa公司)。 1.2支气管上皮细胞BEAS-2B培养正常人支气管上皮细胞BEAS-2B,由国家流感中心馈赠。用无血清BEGM培养基，370C,5%COZ常规培养。待细胞生长至80%一90%融合时传代，接种于24孔板，待细胞生长状态良好，80%左右融合时换为分别含有0,10,50,100ng/ml重组hBD-3的新鲜BEGM培养基(不含氢化可的松)。在6h,24h分别收集上清液和细胞低温冻存。 1.3TLR2,IL-17A,IL-22mRNA测定Trizol法抽提总RNA，纯度Az6o/Aza。在1.8一2.0之间。然后取7.5闪总RNA加人15闪逆转录反应体系中，进行逆转录以获得cDNA。用人TLR2,IL-17A,IL-22对应的PCR引物以及人管家基因阶actin作内参进行:eal-timePCR检测，ABI7500荧光定量PCR仪反应程序设置如下:950C，30s-}950C，5s-550C，30s-72}C,34s〕x40个循环。PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳，进行目的条带确认。结果以2-oocT作为待测基因初始mRNA的相对表达量。PCR引物由上海Invitrogen生物有限公司合成(表1)。 1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)取上清采用双抗体夹心ELISA法检测细胞上清液及沉淀中IL-17A及IL-22，具体操作方法按照说明书进行。每一个样本做复孔，检测重复3次。 1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件分析，数据以均数士标准差表示，各组数据采用单因素方差分析进行比较，正态性检验采用Shapiro-Wilk分析;检验前首先检验各组数据方差齐性，若方差齐性采用LSD检验进行两两比较，若方差不齐采用DunnettT3检验进行两两比较，以P<0.OS为差异具有统计学意义。 2结果 2.1不同浓度重组hBD-3对BEAS-2B细胞TLR2mRNA表达的影响重组hBD-3刺激BEAS-2B细胞6h，随着hBD-3浓度升高，TLR2mRNA表达无显著差异(P>0.05);随着hBD-3刺激浓度的增加，刺激24h,TLR2mRNA表现出明显上调，呈浓度一剂量依赖性(P<0.05)。在不同浓度刺激后，随着刺激时间的延长，TLR2mRNA表达显著上调，呈时间-剂量依赖性(表2)。 2.2不同浓度重组hBD-3对BEAS-2B细胞IL-17AmRNA和蛋白表达的影响不同浓度重组hBD-3分别刺激BEAS-2B细胞6h,IL-17AmRNA表达量则随刺激浓度升高而上调;IL-17A蛋白在10ng/ml和50ng/ml差异无统计学意义，但都比不刺激表达增高。随着hBD-3浓度升高刺激24h,IL-17AmRNA和蛋白显著上调，且差异有统计学意义(P<0.05)010ng/ml刺激组随着刺激时间变化，IL-17AmRNA表达量无显著变化(P>0.05)a100ng/ml刺激24h后工L-17AmRNA表达量显著高于其他组(表2，表3)。 2.3不同浓度重组hBD-3对BEAS-2B细胞IL-22mRNA和蛋白表达的影响重组hBD-3刺激BEAS-2B细胞6h,10ng/ml和50ng/ml刺激组无显著性差异(P>0.05)0100ng/ml刺激组IL-22mRNA表达显著降低。随着hBD-3刺激浓度的升高，刺激24h,IL-22mRNA表达量先上升，后下降。 刺激浓度为50ng/ml时，达到最高值(表2)。刺激6h,IL-22蛋白在0,10,50ng/m]刺激后表达上调，呈现出浓度依赖性;刺激浓度为100ng/ml时明显下降(P<0.05)。刺激24h,10ng/ml刺激组IL-22蛋白表达无明显变化(P>0.05),50ng/ml刺激时IL-22浓度又显著上调(P<0.05)，显著高于其他组，100ng/ml刺激组在6h和24hIL-22蛋白含量无明显变化(P>0.05)(表3)。 3讨论 重组hBD-3刺激BEAS-2B细胞发现，50ng/ml的hBD-3束」激后均可以引起IL-17A和IL-22表达上调，但以IL-22上调为主，而随着HBD3浓度升高和作用时间延长，IL-22表达显著下降，IL-17A则明显上升，这说明hBD-3在调节机体抗炎免疫应答和致炎免疫应答中具有不同的作用。较低浓度下可能以抗炎作用为主，而随着浓度升高，时间延长，抗炎作用逐渐减弱，不足以对抗致炎因子的作用时表现出明显的致炎倾向，并呈现出明显的浓度依赖性。 TLR2受体在此过程中发挥什么作用，目前尚不十分清楚。我们的研究表明hBD-3刺激BEAS-2B细胞24h后，TLR2基因显著上调，推测hBD-3浓度不同，激活的信号转导通路可能亦有差别，较低浓度hBD-3通过TLR2主要诱导IL-22产生;高浓度hBD-3主要通过TLR2诱导工L-17A产生;同时也有可能除TLR2外还有其他受体参与此过程，具体不同的信号传导通路仍需进一步深人研究。 4参考文献 Funderburg NT,Jadlowsky JK,Lederman MM. The Tolllike receptor 1/2 agonists Pam (3) CSK (4) and human betadefensin-3 differentially induce interleukin-10 and nuclear factor-kappaB signalling patterns in human monocytes[J].{H}IMMUNOLOGY,2011.151-160. Rubino SJ,Geddes K,Girardin SE. Innate IL-17 and IL-22 responses to enteric bacterial pathogens[J].{H}Trends in Immunology,2012.112-118. Akdis M,Palomares O,van de Veen W. TH17 and TH22 cells:a confusion of antimicrobial response with tissue inflammation versus protection[J].{H}Journal of Allergy and Clinical Immunology,2012.1438-1449,z1450-z1451.
