青海省2000-2011年麻疹病毒的分子流行病学研究

　　麻疹是由麻疹病毒(Measlesvirus,MeV)引起一种具有高度传染性的急性发热出疹性疾病，上世纪90年代世界卫生组织(WHO)估计全球每年仍有麻疹病例约4000万，其中100万婴儿和儿童死于麻疹，在疫苗可预防的病毒性疾病当中麻疹仍是死亡例数最多的。WHO将麻疹列为继天花和脊髓灰质炎之后第三个要在全世界消除的病毒性疾病。　　中国对2005年世界卫生组织西太平洋地区(WHO WPRO)委员会通过的2012年消除麻疹的决议积极响应，并且力争2012年全国麻疹发病率控制在<1/loo万，无本土麻疹病毒传播〔4〕。MeV属于副豁病毒科麻疹病毒属，为单股负链RNA病毒。麻疹病毒只有一个血清型，但是可以被划分为多个基因型，目前已鉴定有8个基因组(A一H)，共24个基因型正在或曾经在全球流行。在麻疹病毒的基因组中，核蛋白(nucleoprotein,N)和血凝素蛋白(hemagglutimin,H)基因是麻疹病毒基因组中最易变异的基因，特别是N基因竣基末端4}0个核昔酸是麻疹病毒基因变异最大的区域，将该区域作为麻疹病毒分子流行病学研究的靶基因，打一增并测定该靶基因的核首酸序列，并与各基囚型`VHO参考株的序列构建基因亲缘性关系树，以鉴定基因型别。　　中国(未包括中国香港、中国澳门特别行政区和中国台湾地区，下同自1993年许文波等开始进行麻疹的病毒学监测，至今连续18年的麻疹病毒分子流行病学研究表明，Hl基因型是我国绝对一优势的基因型,H1基因型又可进一步被划分为3个亚型H1a,H1玩HIc，其中HIa基因亚型目2000年逐渐成为优势流行基因亚型;Hlh基因亚型呈逐年降低趋势，并转为弱势，其传播于2006年被阴‘断;Hlc基因亚型在1995年后未再发现h同时，自2009年开始，陆续发现输人性基因型麻疹病毒株，分别为D4,D9,D11基因型。青海省于2000年开始开展麻疹病毒的实验室监测工作，为了了解近年青海省流行麻疹病毒基因型的变化情况和基因特征，为青海省麻疹的控制和消除提供分子流行病学的重要基线数据，本研究对2000-2011年间分离的麻疹病毒株进行了分子流行病学研究。　　材料与方法　　1.1标本来源现场采集暴发或散发疑似病例的咽拭子标本，并将标本置于2ml麻疹病毒标本运输液(含有2%牛血清和终浓度含青霉素1000U/ml,链霉素1000LJ/ml的细胞培养液)中，于冷冻条件下48h内送到省级麻疹实验室进行病毒分离y48h内不能及时送检者则放一70℃保存。标本的采集和处理方法参照麻疹监测方案!A。青海省2000-20i1年间疑似麻疹病例的咽拭子标本均由各市流行病学和实验室人员负责采集。　　1.2病毒分离对采集的咽拭子标本使用B95a细胞(2005年之前)或Vero/SLAM细胞(2005年之后)进行病毒分离。吸取上述处理后的咽拭子标本0.2ml接种至75%单层覆盖的细胞，吸附1.5h后弃上清，换含2%牛血清的细胞维持液，每天观察细胞液pH值和细胞病变(CytopathicEffect,CPE)，待75%一90%细胞呈现麻疹病毒特异性的巨细胞融合病变时收获和冻存。B95a细胞和Vero/SLAM细胞由国家麻疹实验室提供。　　1.3RNE9,提取和靶核普酸序列的扩增使用QIAampViralRNAMiniKit(QIAGEN，Valencia，CA，美国)从病毒分离阳性标本的细胞培养液中提取病毒RNA，提取的RNA保存在一20℃待用。根据文献的引物和RT-PCR方法〔9〕，进行N蛋白梭基末端的676个核普酸片段进行扩增。为防止交叉污染，每次实验用去离子水作为阴性对照。使用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行电泳分析。　　1.4核普酸序列测定和分析PCR产物经纯化后采用末端终止法进行双向标记反应(BigDyeTerminatorV3.0CycleSequencingKit，AppliedBiosystems,Fostercity，美国)。标记反应产物再经葡聚糖凝胶G50(Pharmacia，瑞典)纯化后，于ABI3100型序列分析仪(AppliedBiosystems,Hitachi，日本)自动完成序列测定和分析。　　1.5生物信息学分析序列整理使用Sequencher5.0软件(GeneCodes,AnnArbor,Michigan，美国)，将676个核普酸片段序列截成用于分子流行病学研究所需的450个核昔酸片段。同时从GenBank基因数据库下载24个基因型的WHO参考株，中国Hla基因型代表株(China9322株)，中国疫苗株(5191株)，以及2000-2010年来自我国其他27个省份的97株H1基因型麻疹病毒的相应序列，分别使用MEG}5.0软和BioeditSequenceAlignmentEditorsoftware5.0.9软件构建基因亲缘性关系树以及进行氨基酸和核普酸同源性分析。　　2结果　　2.1麻疹病毒的分离和鉴定2000-2011年共收到全省6个地市送检的麻疹疑似病例咽拭子标本共120份，使用B95a细胞或Vero/SLAM细胞成功分离到19株麻疹病毒，阳性率仅为15.83%019株麻疹病毒分离株分别来自西宁(12株)、海东(3株)、海南(1株)、果洛(1株)、格尔木(1株)和海西(1株)。其中2005年分离到的5株麻疹病毒来自西宁市的一所学校的麻疹暴发。19株基因型均为H1型，基因亚型均为Hla。　　2.2青海省2000-2011年麻疹病毒株基因型的确定和基因亲缘性关系分析根据N基因末端450个核昔酸序列，对青海省19株麻疹病毒与其他24个基因型的WHO麻疹病毒参考株构建基因亲缘性关系树(图1)，结果显示，青海省2000-2011年麻疹病毒株与中国Hla基因型代表株China9322处于同一分支，均属于H1基因型，bootstrap值为94%o在亲缘性关系树上，青海省麻疹病毒株可以分为两个不同的簇(Clusterl和Cluster2);2000-2005年流行的麻疹病毒属于第1簇(Clusterl);2009一2011年流行的麻疹病毒属于第2簇(Cluster2)，提示19株麻疹病毒株至少属于2条病毒传播链。同时从GenBank基因数据库中下载2000-2010年来自我国其他27个省份的97株H1基因型麻疹病毒的相应序列，与青海省2000-2011年麻疹病毒株进行基因亲缘性关系分析(图2)，结果显示，青海省麻疹病毒株均属Hla基因亚型，并与其他省份流行的Hla基因亚型麻疹病毒株在基因亲缘性关系和流行时间关系上都较为接近。　　2.3青海省2000-2011年麻疹病毒株核昔酸和氨基酸同源性分析2000-2011年19株麻疹病毒分离株之间核昔酸和氨基酸同源性分别为96.0%-100%和92.7%一100%,2000-2005年间流行的麻疹病毒株与我国H1。基因型代表毒株(China9322)的核昔酸和氨基酸同源性分别为99.1%一99.5%和98.6%一99.3%，而2009-2011年间流行的麻疹病毒株与我国Hla基因型代表毒株(China9322)为98.4%一98.6%和96.0%一97.3%。2000-2005年间流行的麻疹病毒株与2009一2011年间流行的麻疹病毒株的组间遗传距离为0.018,>2000-2005年组内遗传距离(0.003)和2009-2011年组内遗传距离(0.005)，结果进一步提示2009-2011年流行的麻疹病毒株与2000-2005年流行的麻疹病毒株之间存在差异。　　3讨论　　随着我国麻疹消除行动计划的实施，近年麻疹的发病率达到历史最低水平，但要实现麻疹消除的目标，除了要提高麻疹疫苗的免疫覆盖率之外，实验室的血清学和病毒学监测是麻疹消除的重要科学保障，而高敏感性的麻疹病毒分子流行病学监测是其中的重要组成部分，也是麻疹监测系统在实验室网络方面最重要的任务之一。本研究分析200.-2011年青海省麻疹病毒株分子流行病学数据，可以了解本省流行麻疹病毒的基因型和亚型分布，可以鉴别病毒的来源和传播途径，阐述特定区域内随时间推移病毒的变异情况，提供评估麻疹控制策略效果的方法，为科学地阻断麻疹病毒的传播提供重要的分子流行病学的基线数据。　　青海省2000-2011年分离到的19株麻疹病毒经核昔酸同源性和基因亲缘性关系分析，证实全部属于Hl基因型中的Hla基因亚型，无明显地理分布上倾向，和全国的流行情况一致，并且流行期间存在至少2个传播链，其中2000-2005年间流行的麻疹病毒之后未再监测到，提示这时期麻疹病毒的流行可能已经被阻断。同时，在基因亲缘性关系树中可以看出，青海省不同传播链上的麻疹病毒株，分别与近年来在中国其他省流行的Hla基因亚型麻疹病毒在基因亲缘关系和流行时间关系上都很接近，说明青海省麻疹病毒不是独立进化的，而是与中国其他省流行的麻疹病毒在共同进化。2009-2011年流行麻疹病毒与2000-2005年流行的麻疹病毒相比存在一定差异，处于一个独立的小分支，提示麻疹病毒随着时间的推移，可能已经发生一定的变异。　　尽管麻疹病毒的实验室监测在我省已经开展，建立了青海省本省麻疹病毒的毒株库和基因资源库，积累了一定的本省的麻疹病毒分子流行病学研究数据，但是青海省麻疹病毒学监测还比较薄弱，很多地市还没有开展病毒学的监测工作，因而得到的数据还很不全面，应进一步加强并扩大监测范围，同时开展连续监测，建立青海省完整的麻疹病毒分子流行病学基线数据，以全面了解并阐明青海省流行麻疹病毒的基因型和基因亚型的特征，更好的为消除麻疹提供科学的策略。　　4参考文献　　Griffin DE. Measles virus.In fields virology Volume 1.4th edition.Edited by:Knipe HPDM[M].{H}Philadelphia:Lippincott Williams and Wilkins,2001.1401-1441.　　WHO. Progress in reducing global measles death:1999-2004[J].Wkly Epidemiolo Rec,2006.90-94.　　WHO. Progress towards measles elimination,western hemisphere,2002-2003[J].Wkly Epicemiol Rec,2004.149-151.　　卫生部办公厅. 2006-2012年全国消除麻疹行动计划[Z].2006.　　WHO. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles viruses (Update)[J].WER,2001.241-2471.　　XuW B,Tamin A,Rota JS. New genetic group of measles virus isolated in the People's Republic of China[J].{H}Virus Research,1998.147-1561.　　王慧玲,郑蕾,王骥涛. 中国境内首次发现输入性D4基因型麻疹病例[J].{H}病毒学报,2010.103-108.　　卫生部. 麻疹监测方案[Z].2008.