泛醌与Beclin-1及肝脏线粒体关系的相关性研究

　　自噬是细胞通过降解长寿蛋白和受损细胞器，并重新利用生成物质的一种代谢过程。细胞受损时，自噬消化自身受损细胞器，维持细胞稳态为机体提供能量。慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基础上因急性诱因所致的黄疽和凝血功能障碍等急性肝功衰竭。‘漫加急性肝衰竭时肝细胞严重受损。泛酿(CoenzymeQ10,COQ10)是线粒体呼吸链组分之一，具有抗氧化和保护生物膜结构完整的功能。COQ10对慢加急性肝衰竭患者肝脏线粒体是否有保护作用及其可能机制尚未见报道，本研究通过慢加急性肝衰竭大鼠模型研究泛醒是否通过改变自噬水平对慢加急肝衰竭大鼠肝脏损伤起保护作用。　　材料与方法　　1.1材料　　1.1.1试验动物:SPF级SD大鼠，由军事医学科学院实验动物有限公司供应。　　1.1.2主要仪器及试剂:四氯化碳，泛醒，脂多糖，D-氨基半乳糖，鼠抗beclin-1单克隆抗体，beclin-1羊抗鼠二抗，日-actin均购自美国Sigm。公司，beclin-1引物由上海生工生物工程有限公司合成;电泳仪，垂直电泳槽，转移电泳槽购自美国Biorad公司;振动切片机购自德国Leica公司;7900荧光定量PCR仪购自美国ABI公司;JEM-1230透射电镜购自日本Hitachi公司。　　1.2方法　　1.2.1动物及分组:健康雄性SD大鼠30只(4周龄)，体重(170士10)g，分为空白对照组，慢加急肝衰竭观察组(ACLF)和慢加急肝衰竭干预组(ACLF+CoQ10)，每组10只。　　1.2.2慢加急肝衰竭模型制备:腹腔注射50%四氯化碳植物油溶液，每3天1次，剂量为1.5ml/kg,4周后改为2mlikg，持续6周，病理证实肝脏成早期肝硬化，予以腹腔注射100O,g/kg脂多糖(LPS)+0.5g/kgD-氨基半乳糖(D-gal)联合急性攻击一次，构建慢加急肝衰竭模型。　　1.2.3泛醒对慢加急肝衰竭的干预:10只大鼠作为慢加急性肝衰竭干预组在制备慢加急性肝衰竭模型同时增加泛醒植物油注射液每日10mg/kg灌胃，持续6周，病理证实肝脏成早期肝硬化，予以腹腔注射100},g/kg脂多糖(LPS)+0.5g/kgD-氨基半乳糖(D-gal)联合急性攻击一次。　　1.2.4空白对照组:10只，腹腔注射等剂量的植物油。　　1.2.5肝脏病理检查:肝脏组织用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学树脂封片，光镜下观察肝脏组织学病理改变。　　1.3荧光定量PCR用trizol法提取细胞总RNA选用SYBRGREEN混合液，在荧光定量PCR仪上检测自噬相关基因Beclin-1的表达，内参基因为日-actin。引物序列如下:Beclin-1上游引物5'-GGATGGATGTGGAGAAAGGCAAG-3'，下游引物5'-TGAGGACACCC.AAGCAAGACC-3';(3-actin一上游引物5'-GCCCTGAGGCACTCTTCCA-3'，下游引物5'-C(}GATGTCCACGTCACACTT-3'}PCR条件为95℃,15s;60℃，1min;共40个循环。各组13eclin-1mRNA相对含量通过和内参基因汗actin比较得到，其公式为:2一〔cy}}一CyA})。　　1.3.1WesternBlot:取大鼠肝脏组织置于1ml细胞裂解液中，反复冻融3次。10000r/min4℃离心10min，上清即为蛋白。将蛋白定量后样品按4:1加人5x上样缓冲液，混匀后1000C5min变性。　　SDS-PAGE电泳;用湿法电转移凝胶上的蛋白带至硝酸纤维薄膜(cellulosenirate,NC)上;转移后的NC膜加脱脂牛奶封闭过夜;加人稀释的抗Beclin-1(1:1000)抗体，孵育后PBST洗膜3次，以后加人相应二抗，稀释度为1:1000,孵育后洗膜;ECL反应、压片、显影和定影;NC膜经抗体洗脱液清洗后再进行内标(3-actin检测。　　1.3.2透射电镜法:将肝组织切成1mm3大小的4一5块，2.5%戊二醛固定2h后用预冷1xPBS漂洗3次，常规1%饿酸固定2h、梯度酒精脱水、环氧丙烷置换两次，浸于环氧丙烷与Epon812树脂混合物中过夜，树脂包埋、350C聚合24h,450C聚合24h,550C聚合12h,600C聚合24h，半薄切片定位后，用玻璃刀超薄切片，厚度50nm，柠檬酸铅一醋酸双氧铀双重电子染色，JEM-1230透射电镜下观察肝细胞超微结构变化。　　1.4统计学方法应用SPSS16.0统计软件，两组比较采用独立样本t检验，P<0.01差异有统计学意义。　　2结果　　2.1月干小叶结构光镜所见对照组肝小叶结构清晰、完整，肝板及肝血窦呈放射状排列，肝细胞呈多角形，未见炎细胞浸润，小叶结构完整，汇管区小叶间静脉、小叶间胆管等结构可见。慢加急肝衰竭组显示肝脏在肝纤维化基础上出现大块肝细胞坏死，偶见残存肝细胞，大量中性粒细胞浸润，坏死面积达100%，肝窦扩张淤血伴淤血，偶见肝细胞嗜酸性变。　　大部分肝小叶结构消失。干预组显示肝细胞坏死，但坏死面积约80%，可见纤维间隔，大部分肝小叶结构完整。　　2.2线粒体结构电镜所见透射电镜下，对照组线粒体峙结构清晰，线粒体膜完整(图1A)，慢加急肝衰竭组大部分线粒体内容物已经降解，线粒体呈空泡状伴内质网扩张(图1B)。干预组多数线粒体结构尚存，线粒体膜完整性欠佳，电子密度升高，线粒体峙结构不清晰，线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张，自噬小体形成(图1C,箭头所指为自噬小体)。　　2.3肝细胞中beclinlmRNA表达水平荧光定量PCR结果显示，慢加急肝衰竭组自噬水平较对照组显著降低(P<0.01)，而干预组的自噬水平较慢加急肝衰竭组显著升高(P<0.01)(图2)。　　2.4肝细胞中beclinI蛋白表达水平WesternBlot结果显示，模型组beclinI蛋白表达较对照组显著减少，干预组beclinI表达较慢加急性肝衰竭组显著增加。　　3讨论　　Chen等运用大鼠脓毒血症研究发现随着脓毒血症的发展，大鼠肝脏自噬水平不断增高，到脓毒血症终末期时自噬水平突然降低f3}47。此研究结果与我们观察到在慢加急性肝衰竭大鼠肝细胞中自噬水平明显降低相一致。　　Angeles分离CoQ10缺陷遗传病的患者的成纤维细胞，离体培养研究其生理变化，发现反映线粒体功能和膜完整性的指标线粒体渗透性转换增高，其增大说明CoQ10缺陷患者线粒体膜内外渗透失衡，线粒体病变。本研究中干预组电镜下显示线粒体虽膜完整性欠佳但结构尚存，同时有自噬小体形成。由此推断CoQ10与线粒体自噬相关，而慢加急肝衰竭大鼠补充CoQ10后自噬基因Beelinl水平增高，线粒体结构较模型组明显好转，说明CoQ10可能通过线粒体自噬去除受损严重的线粒体并将自噬Jt}物用于受损较轻的线粒体保护慢加急肝衰竭大鼠肝脏线粒体膜来减缓肝损伤。　　4参考文献　　Affonso S,Alessandro T,Alison K. Autophagy induction extends lifespan and reduces lipid content in response to frataxin silencing in C.elegans[J].Experiment Gerontol,2013.191-201.　　dromachi K,Fabio F,Romilda C. Autophagy and apoptosisrelated genes in chronic liver disease and hepatocellular carcino[J].{H}GASTROENTEROLOGY,2012.118.　　Ilse V,Jan G,Sarah D. Insufficient Activation of Autophagy Allows Cellular Damage to Accumulate in Critically Ill Patients[J].{H}Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,2011.E633-E645.　　Chen W,Chen H,Chiang PC. Suppression of autophagy in rat liver at late stage of polymicrobial sepsis[J].{H}SHOCK,2011.506-511.　　(A)ngeles R,Cordero E,Salviati. CoenzymeQ deficiency triggers mitochondria degradation by mitophagy[J].{H}AUTOPHAGY,2009.19-32.