肿瘤坏死因子α增强肾小球系膜细胞胞内钙释放参与肝肾综合征发病机制

　　肝肾综合征(HRS)是肝硬化及肝衰竭晚期严重并发症，特点是肾脏无形态学改变只有功能异常，肾小球滤过率(GFR)明显下降。暴发性肝衰竭大鼠肾血管平滑肌细胞和肾小球系膜细胞(GMCs)的I型1,4,5一三磷酸肌醇受体(IP3RI)表达增加2‘，并与血中高浓度的肿瘤坏死因子a(TNF-a)有关，其确切的信号转导机制不明。HRS患者血清中内皮素(ET)等缩血管物质水平明显增高是GMCs收缩的前提。GMC、收缩联系着胞内钙释放与胞外钙内流，前者引起的胞内游离钙离子浓度(}Caz+}i)增加与1,4,5一三磷酸肌醇受体(IP3Rs)密切相关，后者作用可被应用无钙缓冲液排除。笔者应用钙荧光指示剂Fluo-3/AM标记及激光共聚焦显微镜，探讨TNF-。处理后的GMC、对ET刺激引起的单个细胞「Cat」及细胞收缩的影响，并通过IP3Rs阻断剂2-氨基乙氧基联苯硼酸盐(2-APB)阻断后的变化，探讨TNF-a参与HRS发生的可能信号通路。　　1材料与方法　　1.1材料大鼠系膜细胞株，武汉生物细胞库;DMEM培养液、标准胎牛血清，Gibco公司;TNF-cx,Fluo-3/AM,ET-1,EGTA,Sigma公司;2-APB,Merck公司;3.5cm薄底平皿，上海荣柏生物科技有限公司;TritonX-100，普瑞麦迪北京实验室技术有限公司。共聚焦显微镜，德国Du"sseldorf公司。实验时间为2011年3月至2011年6月，地点为中国医科大学中心实验室。　　1.2实验分组预实验TNF-a浓度分别为10,20,50,100,200剔L，选择趋势最明显的100群L浓度做实验。分正常对照ET刺激组(Oh组)、TNF-a处理4hET刺激组(4h组)、TNF-。处理24hET刺激组(24h组);另设上述3组于加ET前10min加2-APB(即2-APB拮抗正常对照ET刺激组、2-APB拮抗TNF-。处理4hET刺激组、2-APB拮抗TNF-oc处理24hET刺激组)，预实验2-APB浓度20,40,80,100N.,mol/L，采用具有完全阻断效应的最低浓度40},mol/L。　　1.3单个细胞[Caz十)i测定GMCs接种于35mm薄底平皿，TNF-x(100}.,g/L)孵育0,4,24h，弃培养液，5N.,mol/LFluo-3/AM37℃避光负载45min，冲洗后换无钙缓冲液1ml，共聚焦显微镜测定单个活细胞内Cat+荧光强度值(FI)发射波长505nm，激发波长488nm)。测定基础值后，加人ET观察FI的变化(预实验ET浓度分别为0.1,1,10,100nmol/L，选择趋势最明显的100nmol/L)。采用LSM510软件分析，〔Ca2+〕i=Kdx(F一Fmin)/(Fmax一F)oKd为解离参数(320nmol/L)。F:实测荧光强度值;Fmax:胞内Cat+饱和时FI值，胞外液有钙时加人1%TritonX-100测得;Fmin:胞内无Ca2‘时FI值，加人10N.,mol/LEGTA后测得。实验结果以受刺激后[CaZ十」i的升高值表示，每组样本选3个细胞测量，并用不同代细胞重复4次。　　1.4细胞收缩反应的测量参照文献[5]，在单个细胞「Cat十」i测定连续拍照，应用LSM510软件分析图像，测量细胞给药前后表面积变化提示收缩程度。细胞表面积的变化百分比=(收缩前细胞表面积一收缩给药后细胞表面积)/收缩前细胞表面积x100%。　　1.5统计学处理采用SPSS10.0软件分析，实验结果以x士‘表示，各组间比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析(LSD法)，P<0.OS为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1单个细胞「CaZ'}i的测定静息状态下TNF-。孵育。,4,24h组，GMCs内的〔Cat`}分别为(441.95士172.87)nmol/L}(400.19士224.92)nmol/L,(491.48士155.70)nmol/L,3组间差异无统计学意义(F=0.718,P>0.05)aET刺激约1min后钙离子浓度有一个迅速增加(即峰值升高相)，峰值荧光的发生时间不完全一致(图lA,B)oTNF-a孵育4,24h组，[Cat'}i上升幅度明显增强，4h组峰值为(648.08士267.11)nmol/L,24h组峰值为(879.30士260.29)nmol/L，而Oh组峰值仅为(619.93士258.94)nmol/L;4h组与Oh组、24h组与Oh组仁Ca2+}i峰值升高百分比差异具有统计学意义(F=5.486,4hvs0h.P<0.05;24hvs0h;P<0.05;24hvs4h.P>0.05)。见表I}3组此效应均可被2-APB完全阻断，表现为对ET刺激无反应(图1C)2.2Gl'ICs表面积的测量静息状态下TNF-a孵育0,4,24h组的G}MCs面积分另}!为(26931531)林m'`,(2677士493)},m-,(2776士412)l.A,m''，三组间差异无统计学意义(F二0.145,P>0.05)。加人ET后约lmin就出现了可见的细胞收缩变化，表现为胞突变细变短，此后这种变化逐渐明显;约4min时细胞形态变化最为明显，胞突回缩，胞体变圆，细胞长度与直径均明显缩小(图ID,E)。细胞表面积测量发现:FT刺激分别使0,4,24h组的细胞面积缩小到(2436士474)林m，(2198土340)林nlw和(2260士553)},,m2;4h组与Oh组、24h组与Ol、组的细胞面积缩小百分比差异具有统计学意义(F=4.001,4hvsOh:P<0.05;24hvsOh:P<0.O5;24hvs4h;P>0.05)。见表1.　　3讨论　　肝肾综合征时GFF明显下降，其确切发病机制不明。被普遍接受的假说是山于内脏血管扩张最终导致一了l肾脏血管收缩及‘肾川主1讯流低灌注，而局部产生的一氧化氮是引起内脏血管扩张的原因6此外，细菌移位、各种细胞因子、肠系膜血管生成也是内脏血管扩张的原因;肾脏自调节功能的改变也参与了肾脏血管收缩7近来文献证实了拮杭『TVF-cx可预防HRS的发生，并推测其可能参与了内脏高功力循环与炎症过程，但确切的信号转导机制不清一h、本课题组前期研究证实了TNF`_。有增强肾血管收缩的作用9。GMC;、与血管平滑肌细胞相似，其收缩可减少肾小球毛细血管拌数量，减小滤过面积及滤过系数，导致〔}I'R降低。G}'ICs的收缩受ET等多种血管活性物质调节，后一者与细胞膜上相应受体结合，激活磷脂酶C的日亚型，催化质膜磷脂}l}(I1L醇二磷酸水解，生成三磷酸肌醇(1P3)和甘油二醋Il'3与11'3R*结合促进内质网储备Ca'十释放引起细胞收缩胞内Ca'十来源于胞外钙内流和胞内钙释放_笔者选用无钙细胞外液，故ET引起-CaZ十},i的变化只依赖于胞内钙库引起的C;a'"释放。在非兴奋细胞包括GMC、内，Il'3R、而非雷尼碱受体是主要的C:a-.释放通道.这一点可被2-APB阳_断Ca-释放实验来证明FLuo-3iA1M是常用的钙荧光指示剂，其与胞内游离钙呈高度特异性结合，其FI值与「Ca'十}i成正比。本实验结果表明:(劝与对照组相比，'I'NF'-cx可增强I;T刺激引起的[Ca-'}增高的幅度，但一FNF-cx24H组与TiNF-c}4h组组间差异无统计学意义(P>O.OSj,T11F-。的这种与E1'的协同效应可被40}M的2-APT3完全阻断，故.I'Nh,-。间接影响胞内纽Ca_-,,i是通过II'3R:通路起作用的厂(2)Git-ICs内址CaZ+}i的升高伴随着(}Il'fCs的收缩，与对照组相比，hN,F_a可增强GVICs收缩前后的表面积变化幅度，但TNF-a24h组与TNF-cY41:组组问差异无统计学意义(P>()0}1，故TNFa对I:T引起G1ICs收缩起协同作用笔者指出:F-a通过I}'3lis通路增强;'ICs胞内钙释放可能是导致HRS时GFR下降的一个重要事件，这条信号通路与促进核因子一KB受体活化因子配体一R}I}'I\l.诱导小鼠骨髓巨llg细胞破骨细胞形成与分化的信号通路以及(,\F’一。调节神经元突触内钙信号一的通路是一致的’ofi，能否在1IRs的动物模型上通过阻断IP3Pis通路终止T!'F-。引起的GFR下降是下一步研究方向。　　参考文献　　徐苗国. 前列地尔脂质体联合黄芪注射液治疗肝肾综合征的临床对照研究[J].中国医师进修杂志,2011,(31):12-15.doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4904.2011.31.005.　　闻颖,崔巍,刘沛. 暴发性肝衰竭时肾脏Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达增加[J].中华肝脏病杂志,2007,(06):403-407.doi:10.3760/j.issn:1007-3418.2007.06.002.　　王静艳,孙景春,吕飒. 肿瘤坏死因子-α增强大鼠肾小球前小动脉平滑肌细胞内Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体表达[J].中华内科杂志,2002,(02):86-89.doi:10.3760/j.issn:0578-1426.2002.02.005.　　Kardum D,Fabijani(c) D,Luki(c) A. Correlation of endothelin-1 concentration and angiotensin-converting enzyme activity with the staging of liver fibrosis[J].Collegium Antropologicum,2012,(02):413-418.　　Martín-Garrido A,Boyano-Adánez MC,Alique M. Hydrogen peroxide down-regulates inositol 1,4,5-trisphosphate receptor content through proteasome activation[J].Free Radical Biology and Medicine,2009,(10):1362-1370.　　Prakash J,Mahapatra AK,Ghosh B. Clinical spectrum of renal disorders in patients with cirrhosis of liver[J].Renal Failure,2011,(01):40-46.　　Wong F. Recent advances in our understanding of hepatorenal syndrome[J].Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology,2012,(07):382-391.　　Riaz H,Tahir F,Muuir MB. On the role of pentoxifylline versus other TNF alpha inhibitors in the prevention of hepatorenal syndrome[J].Medical Hypotheses,2012,(04):552-553.