大鼠被动型Heymann肾炎模型建立与抗体剂量关系的探讨*

　　作者：王锋，范亚平，达展云 作者单位：南通大学附属医院肾内科，南通226001

　　【摘要】 目的：通过对被动型Heymann肾炎模型的建立与抗体剂量关系的研究，进一步探讨膜性肾病的发病机制。方法：成年雄性SD大鼠分为A、B、C 3组，分别经尾静脉注射抗 FX1A抗血清1 ml/100g、0.5 ml/100g以及生理盐水1 ml/100g，1周后检测24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清肌酐、血清三酰甘油以及总胆固醇，分别在普通光学显微镜和透射电子显微镜下观察大鼠肾组织的病理学改变。结果：被动型Heymann肾炎模型的建立与SD大鼠尾静脉注射抗FX1A抗血清的剂量存在正相关。结论：膜性肾病的发生可能与抗体剂量有关。

　　【关键词】 膜性肾病;被动型Heymann肾炎;过碘酸银甲胺染色

　　Antibody dose-response relations in passive heymann nephritis rat

　　WANG Feng , FAN Yaping, Da Zhanyun (Department of Nephrology,the Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the relations of antibody dose-response in passive heymann nephritis and try to provide the evidence for membranous nephropathy in pathogenesis. Methods: Male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into three groups and were injected with anti-FX1A serum(1 ml/100g, 0.5 ml/100g) and physiological saline (1 ml/100g) in difference through caudal vein. After a week, twenty-four hours urine protein, serum albumin, secrum creatinine, secrum triglyceride and secrum total cholestorel were observed respectively. Glomerular lesions were measured by light and electronic microscope. Results: The SD rats developed the typical clinical and pathological patterns of MN in response to an optimum dose of anti-FX1A serum. Conclusion: MN generation may be related with antibody doses.

　　[Key words] Membranous nephropathy; Passive Heymann nephritis; Periodic acid silver methanamine

　　膜性肾病(membranous nephropathy, MN)是成人肾病综合征常见的病理类型之一，但其发病机理尚未明确。大鼠Heymann肾炎(Heymann nephritis, HN)模型的病理改变及表现与人类膜性肾病十分相似，已作为人类膜性肾病的模型普遍应用，其中被动型Heymann肾炎(passive Heymann nephritis, PHN)系予大鼠直接静脉注射抗肾小管刷状缘提取物(Fx1A)的抗体(或抗血清)诱发，模型较为稳定，制备所需时间相对较短，被广泛用于实验研究[1]。有关PHN模型建立过程中Fx1A抗体的剂量反应关系国内外报道较少，本研究旨在探讨PHN的建立与抗体剂量反应的关系，为膜性肾病发病机制的实验研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠，体重200~250 g，由南通大学实验动物中心提供;普通级健康雄性新西兰大耳兔，体重2.5 kg，购自南京金陵种兔场。饲养环境温度维持在(20±2)℃，分笼饲养，标准饲料，自由摄水，12 h交替照明。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Fx1A提取 参考Malathi等(1979)方法改良。健康雄性SD大鼠3%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉后于无菌条件下取肾皮质，按1∶30 (v/w)加入50 mmol/L甘露醇/2 mmol/L Tris HCl(pH 7.0)在冰浴中制成匀浆;加1 mol/L CaCl2至终浓度为10 mmol/L，4℃ 3 000 g离心15 min，取上清液，43 000 g再离心20 min，取沉淀用50 mmol/L甘露醇/2 mmol/L Tris HCl(pH 7.0)重复洗涤1次。重复上述步骤1次。取沉淀加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)溶解即为Fx1A，考马斯亮蓝法于600 nm波长比色进行蛋白定量。置-20 ℃冰箱备用。

　　1.2.2 Fx1A抗血清的制备与提取 将 Fx1A溶液与等量完全弗氏佐剂充分乳化后, 于新西兰大耳兔的颈部、背部、腹部以及四肢足垫皮下分点注射，每周1次，共免疫6 次。从新西兰大耳兔耳缘静脉取血1 ml，离心分离血清，用免疫双向扩散法测定抗血清的效价，达1∶32以上后经腹主动脉取血，置57℃水浴30 min灭活补体，随后以5000 g离心10 min，吸取上清即为Fx1A抗血清，分管置-20 ℃冰箱备用。

　　1.2.3 实验分组与模型的建立 将18只健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为A、B、C 3组，每组6只。A、B、C 3组分别经尾静脉一次性注射Fx1A抗血清1 ml/100g、0.5 ml/100g以及生理盐水1 ml/100g。

　　1.2.4 观察指标 1周后将大鼠分别单独置入代谢笼，收集24 h尿液，准确测量尿液体积并行24 h尿蛋白定量测定(考马斯亮蓝法)。次日取血标本，全自动生化分析仪测定血清白蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)及胆固醇(TC)水平。将肾组织分别用4%多聚甲醛固定或3%戊二醛固定后行苏木素-伊红染色、六胺银染色或醋酸铀染色在普通光镜或透射电镜下观察大鼠肾组织的病理学改变。

　　1.3 统计学方法 所有计量资料均采用Stata7.0统计软件进行统计分析，结果以x±s表示。所有数据进行方差齐性检验后进行单因素方差分析。两两比较用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 一般情况 实验观察过程中，C组大鼠精神状态良好，体重增加，皮毛光滑亮泽;A、B两组大鼠出现不同程度的摄食减少、体重减轻、尿量减少等现象，A组较B组更明显。

　　2.2 24 h尿蛋白定量的改变 1周后A组24 h尿蛋白定量为19.61±4.40 mg/d，B组为10.37±3.15 mg/d，C组为4.91±1.04 mg/d，A、B组24 h尿蛋白定量较C组增加(P<0.05)，A组较B组高(P<0.05)。

　　2.3 两组大鼠血清白蛋白以及肌酐、总胆固醇和三酰甘油的改变 见表1。观察7天后A、B、C 3组大鼠血清白蛋白及肌酐、总胆固醇和三酰甘油水平无明显变化 (P>0.05)。

　　2.4 肾脏组织病理学改变 HE、PASM染色光镜下B组和C组大鼠肾小球毛细血管袢开放良好，未见肾小球基底膜(GBM)增厚以及系膜增生，A组可见GBM节段性增厚，未见系膜增生;3组肾小管间质均未见明显病理改变(图1)。透射电镜下C组上皮下无电子致密物沉积，GBM无增厚，足突清晰;而A组可见散在上皮下电子致密物沉积，GBM节段性增厚，部分足突可见融合;B组可见少量上皮下电子致密物沉积，未见足突融合(图2)。

　　3 讨 论

　　MN病理特点为脏层肾小球上皮细胞下免疫复合物沉积不伴有明显炎症反应，后期有GBM弥漫性增厚，免疫沉积物通常为IgG4和补体C5b-9[2]。引起肾小球损害的基本病理机制为肾小球脏层上皮下免疫复合物形成与沉积和补体激活[2，3]。尽管对膜性肾病的研究已取得很多进展，但MN的发病机制仍没有完全明确，进一步探索其发病机制，寻找更为有效的防治措施具有重要的理论和临床意义。

　　目前人们对膜性肾病发病机理的认识主要来自大鼠Heymann肾炎动物模型。本实验参考了Malathi等建立的被动型Heymann肾炎方法。造模后1周A、B两组大鼠出现不同程度的摄食减少、体重减轻、尿量减少、明显蛋白尿等与人类膜性肾病相似的表现，血清白蛋白、肌酐、总胆固醇以及三酰甘油等未出现具有统计学意义的变化，可能与本实验观察Heymann肾炎早期有关。普通光学显微镜检查A组大鼠较B、C两组表现为肾小球节段性基底膜增厚，透射电子显微镜检查A组大鼠见肾小球基底膜节段性电子致密物沉积，部分足突可见融合，B组大鼠见肾小球基底膜节段性电子致密物沉积，未见有足突融合，表明本实验所制备的Heymann肾炎模型较为成功和可靠。而A组大鼠与B组大鼠表现出不同程度的病理改变，提示被动型Heymann肾炎模型的建立可能与SD大鼠尾静脉注射抗FX1A抗血清的剂量存在正相关关系。

　　本实验成功地制备了被动型Heymann肾炎模型，通过对A组与B组大鼠24小时尿蛋白定量以及光学显微镜和电子显微镜组织学检查的比较，间接验证了在Heymann肾炎中原位免疫复合物形成是其可能的发病机制之一，也间接验证了膜性肾病的发生可能与诱导抗体的剂量有关，但其相关程度还有待进一步研究明确。

　　【参考文献】

　　[1] 冯金忠，李 军. Heymann肾炎的发病机制[J].国外医学·泌尿系统分册，2000，20(1)：26-27.

　　[2] 王瑞石， 刘志红. 膜性肾病的发展机制[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15(2)：161-166.

　　[3] Squarer A, Lemley KV, Ambalavanan S, et al. Mechanisms of progressive glomerular injury in membranous nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 1998, 9(8):1389-1398.

　　[4] Kerjaschki D.Pathogenetic concepts of membranous glomer-ulopathy (MGN)[J]. J Nephrol, 2000, 13(Suppl 3):S96-100.