多重聚合酶链反应法在口岸检疫传染病检测中的应用
发表时间：2014-08-20 浏览次数：1238次
面对严峻的国内外突发急性传染病疫情的流行趋势，传统的传染病监测方法已不能满足口岸快速检验的需要。多重PCR的优点在于能够同时分析不同的DNA序列，可以实现-次PCR反应检测多种病原体的目的。本研究对多重PCR法用于检测结核分枝杆菌、霍乱弧菌及疟原虫等传染病病原的应用进行观察，现将结果报道如下材料与方法. 一、临床样本和主要材料 24份疟疾患者滤纸干血斑样本采自从非洲、东南亚等疟疾流行区回国人员中疟疾患者，54份结核分枝杆菌阳性痰样本培养物DNA和8例霍乱弧菌DNA来自河南省CDC,35份非结核痰样本来源于呼吸科癌性胸膜炎、急性支气管炎、慢性支气管炎及肺炎等患者。 主要试剂2XTxterERaqPCRMasterMi、购自LifeFeng公司，琼脂糖、DNAMarker等购自北京赛百盛基因技术公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增仪(GeneAmpPCRsystem9600)为美国PE公司产品。结核分枝杆菌、霍乱弧菌及疟原虫标准菌株DNA来源于郑州大学公共卫生学院。 二、引物及目的基因的选择 参考文献[1-3]选择和构建属间特异的序列及相应引物。 1.霍乱弧菌 针对结构蛋白基因toxR设计引物:5'-CCTTCG,4TCCCC-TAAGCAATAC-3',5'-AGGGTTAGCAACGATGCGTAAG3';针对肠毒素基因〔vtxA设计引物:5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG3',5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3'。扩增片断长度分别为779饰和564bpa2.结核分枝杆菌两对引物分别对应于结核分枝杆菌65KD表面抗原和插人序列IS6110，其扩增产物长度分别为383by和123by。引物对A:A15'-GAGATCGAGCTGGAGGATCC-3',A25'-AGCT-GCAGCCCAAAGGTGTT-3';引物对B:Bl5'-CCTGCGAGCGTAG-GCGTCGG3'，B25’-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG3' 3.疟原虫 根据EMBL数据库中恶性疟原虫与间日疟原虫红内期SSRrRNA基因序列，设计3条引物Mfv,M.和Mv3}4}oMf,序列:5'-CGACGGTATCTGATCGTCTTC-3',Mf3:5’一CGGGTAGT-CATAGATTGAGTTC-3'，Mv3:5’一CAACGCTTCTAGCTTAATCCAC-3'。扩增产物分别为274饰和421饰。 三、模板的制备 血液:剪下滤纸干血斑，置O.SmLEP管，加人50匹5%chelex-100，充分振荡30s，煮沸10min，再充分振荡30s,15000xg离心，取上清为模板。痰液:痰液加人大约4倍体积的4%NaOH，充分摇匀，室温下放置15min液化，取1.5mL液化后的痰样本于离心管中，12000xg离心5min,去上清，沉淀再加无菌生理盐水1mL洗涤xg离心2min。将沉淀物加人DNA提取液50匹充分混匀，煮沸10min,12000xg离心5min，吸取上清液为模板。 四、PCR扩增反应 30pL反应液中含2XTxterERaqPCRMasterMix各15/L,引物各0.5pmol/匹，模板DNA各5匹。混匀后PCR扩增仪进行扩增:94℃预变性5min，变性93℃40s，退火55℃30s，延伸72℃45s，共32次循环，最后增加1次5一10min的延伸。1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在成像仪上观察有无特异性扩增带。先对标准菌株进行扩增，作为多重PCR反应调试的模板及阳性对照，同时将以不加模板的体系作为阴性对照。 五、多重PCR灵敏度及特异性评价 用临床确诊样本验证构建的多重PCR体系的灵敏度，并用临床非结核样本进行多重PCR检测结核分枝杆菌的特异性验证。 结果 一、多重PCR检测的有效性 本次构建的多重PCR体系用于检测结核分枝杆菌、霍乱弧菌及疟原虫的标准菌株，均可见特异性扩增带，条带长度与预期设计相符;而用于阴性样本的检测均未出现特异性扩增带。 二、多重PCR检测的灵敏度和特异性 在54份结核分枝杆菌样本中检出阳性52份，灵敏度达96.30%;此外，用非结核样本验证该法的特异性检验结果显示，35份阴性样本均未扩增出特异性条带，提示多重PCR用于筛检结核分枝杆菌的特异性达100.00%。其他菌株，如霍乱弧菌及疟原虫的检测详见表1. 讨论 多重PCR由于同时涉及多套引物和多个模板，因此对反应的负面影响因素更多且更为剧烈其中以各引物之间的比例及相互作用最为关键。本组试验参照文献,选择和设计了针对结核分枝杆菌、霍乱弧菌及疟原虫的特异性引物，用于临床验证性试验，显示出了较好的灵敏度和特异性。对于结核分枝杆菌的检测，其灵敏度达到%.30%，特异性为100.00%，对于疟原虫及霍乱弧菌的检测，灵敏度也达到了95.83%和87.50%，表明本次试验设计的引物、反应体系中各试剂的配比及反应条件均较为合适。 多重PCR具有普通PCR无可比拟的优越性，除了1次反应可以检测多个基因型，减少工作量外，还提供了内部对照，能够指示模板的数量和质量，在遗传疾病和感染性疾病的诊断，个体多重感染及群体感染病原体的监测，辅助人类基因组构成分析等方面有着广泛的应用敏感、快速，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病原体的检测。因而多重PCR用于口岸传染病的检疫，能够实现多样本的同时检疫，从而大大缓解口岸检疫的人力、物力及时间的投人，加快检疫结果的报告，提高口岸的服务效率。 参考文献 Broken KB,Haagensen JA,Tolker-Nielsen T. Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections[J].Clinica Chimica Acta,2007,(1/2):1-11. Mokaddas E,Ahmad S. Development and evaluation of a multiplex PCR for rapid detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex members from non-tuberculous mycobacteria[J].Japanese Journal of Infectious Diseases,2007,(02):140-144. 侯瑞生,王丽,陈文玲. 多重聚合酶链反应方法在结核杆菌检测中的应用[J].中国国境卫生检疫杂志,2007,(06):387-388.doi:10.3969/j.issn.1004-9770.2007.06.020. 蔡贤铮,区采莹,王香凤. 疟疾双重检测方法的建立和初步应用研究[J].中国热带医学,2001,(01):3-5.doi:10.3969/j.issn.1009-9727.2001.01.003.
