产金属β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的研究进展

　　肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumorciae)广泛分布于自然界，已成为仅次于大肠埃希菌的最重要的条件致病菌，能够引起全身各部位的感染。其耐药的主要原因是产生质粒介导的各内酞胺酶，主要有超广谱各内酞胺酶(ESBLs)和AmpC酶，如两种同时存在，则可对多种抗菌药物耐药。由于碳青霉烯类抗生素对ESBLs和AmpC酶稳定性较高，碳青霉烯药物如亚胺培南、美罗培南被推荐为治疗产ESBLs类细菌引起严重感染的一线药物，因此耐碳青霉烯类药物的肺炎克雷伯菌的出现是临床非常关注的。　　一、耐药酶的分类　　肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的机制可能包括以下方面:(1)高产AmpC酶或ESBLs合并外膜蛋白缺失;(2)青霉素结合蛋白对碳青霉烯类亲和力的改变;(3)碳青霉烯水解各内酞胺酶的产生。其中最主要的机制是碳青霉烯酶的产生。金属(3_内酞胺酶(MBLs)是一类活性位点含有金属离子的冬内酞胺酶。目前在肺炎克雷伯菌中发现的金属酶包括IMP型、VIM型、NDM-1，能够水解亚胺培南或美罗培南一类的碳青霉烯类抗生素。　　1.IMP型金属酶　　1991年，日本首次在泌尿道感染的患者样本中分离出产金属酶的孰质沙雷菌菌株Tn9106，后被证实为IMP-1型MBLs。随着研究的深人，全球许多国家都相继报道了MBLs，尤其是东南亚、欧洲和拉丁美洲等地区的国家，目前报道有23个亚型。IMP-1酶N端18个氨基酸残基是信号肤。　　Znz+,H扩+,Fez+及乙二胺四乙酸EDTA能100%抑制该酶活性，Cuz+能抑制86%的酶活性，但在含Zn-Cl:的缓冲液中，该酶活性能够恢复。Caz、M扩+不能抑制IMP-1酶活性。IMP类MBLs均位于整合子或质粒上，虽然其氨基酸序列的一致吐都在85%以上，但由于碱基突变或氨基替换，使酶的底物轮廓及水解效率都不尽相同。目前，新加坡、巴西、黎巴嫩、希腊等国家均从肺炎克雷伯菌中发现IMP-1的存在.2001年，我国台湾省在1株多重耐药的肺炎克雷伯菌中发现的质粒介导的I}}IP-8，与IVIP-2相比仅有2个氨基酸差异，其同源性大于IMP-1，产IMP-8的转化株大肠埃希菌，表现为对青霉素类、头抱菌素类及碳青霉烯类的敏感性降低，而对氨曲南依然敏感，接合试验证实携带IMP-8的耐药基因盒位于质粒上，可以通过质粒传递。　　blalMP-4与其他3种耐药基因qacG2,aac%14和catB3共同编码整合子。IMP-4与IMP-1相比有10个氨基酸的不同，与IMP-2相比则有3?个氨基酸的不同02004年在澳大利亚一家医院的肺炎克雷伯菌中分离出IMP-4i-sl。在中国浙江分离的肺炎克雷伯菌除发现工MP-4型金属酶外，还发现了KPC-2及喳诺酮类耐药基因qnr位于同一个接合质粒上.　　上海发现2株携带IMP-4的肺炎克雷伯菌株，同时检测到16SrRNA甲基化酶基因annA和超酶bLaSHV12，共同存在于整合子上的IMP-4和anrtA含有插人序列，这种插人序列与杭州发现的霍乱弧菌0139质粒密切相关。天津地区发现1株携带IMP一的肺炎克雷伯菌株，该株菌同时携带SHV-I1和'I'EM-1基因，IMP-4基因位于工类整合子5’端.　　2.VIM型金属酶　　目前，VIM家族已分离出15种亚型，并可分为3个群，分别以VIM-1,VIM-2,VIM-7为代表，VIM-1和VIM-2两型是目前全球分布最广的MBLs。肺炎克雷伯菌中存在的基因型有VIM-1,VIM-4,VIM-12以及新发现的VIM-19Giakkoupi等12-对临床分离的17株肺炎克雷伯菌产VIM-1进行分析发现，VIM-1基因盒大约为3kb，包括bIaVIM-1,aac6,dhfrl和。udA，是工类整合子可变区的一部分。Cagnacci等报道了意大利首例产VIM-1的肺炎克雷伯菌，发现其对碳青霉烯类药物的耐药性是多变的，美罗培南的MIC值从4-64mg/L不等，其中MIC值最高的菌株同时缺少外膜蛋白OMPk13Luzzaro等.首次在意大利发现1株产VIM-4的肺炎克雷伯菌和1株产VIM-4和SHV-12的阴沟肠杆菌，接合试验发现VLM-4均存在于质粒上，且可转移到大肠埃希菌上。同大肠埃希菌J53受体株相比，转移的接合子对包括碳青霉烯的R-内酞胺酶类抗生素和氨基糖昔类抗生素敏感性均降低;同供体菌相比，转移的接合子还产生了可抑制EDTA的碳青霉烯酶活性。2006年土耳其分离出20株耐亚胺墙南的肺炎克雷伯菌，除了产金属酶VIM-4外，还有产超酶CTX-M-15,AmC酶、CMY-4酶。核昔酸序列分析证实VIM-4基因是I类整合子的一部分，且基因盒(从5’到3')包括bIaVIM-4,aacA7,d;"A1和aadA14种基因　Tokatlidou等16一从肺炎克雷伯菌中检测出VIM-12型MBLs，他们认为VIM-12是VIM-1和VIM-2的杂合体，这与Ikonomidis等‘7的观点一致。VIM-12同VI1-1相比，在3’端有8个核昔酸的差异，而这8个核昔酸正好与VIM-2相应位置的核普酸序列配对一13J最近在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中发现一种新型MBLs-VIM-19，可高度水解碳青霉烯类抗生素，但对几种超广谱头泡菌素水解性低，同其他所有类型VI_1}I型相比，VIM-19活性位点外有一个Lys215的不同，且:vs215与Arg228的联合解释了它比其他类型训M有着更高的水解碳青霉烯类抗生素的活性。　　3.NDM-1型金属酶　　Yong等〔19〕在印度分离出一种新的金属酶一NDM-1。基因库和扩增显示其有3个与耐药有关的区域:第1个区域包含b1aCMY-4，其侧翼是ISEcPl和blc;第2个区域约8kb大小，包括一个复杂的I类整合子以及基因盒arr-2一种新的红霉素醋酶基因)、ereC,aadA1和cmLA7，在qac/sul下游发现一个完整的ISCRl元件;第3个区域由NDM-1组成，侧翼分别是肺炎克雷伯菌DNA和缩短的IS26元件。　　NDM-1与其他金属酶不甚相似，与VIM-1/VIM-2最为相似，但其同源性只有32.4%。除此之外，NDM-1在162和166位点之间还有一个额外的插人序列。NDM-1的相对分子质量为28000，可以水解除氨曲南以外的所有R-内酞胺类抗生素。最近有报道我国湖南地区发现1株携带NDM-1的肺炎克雷伯菌，NDM-1基因可在不同菌株之间进行转移。黎巴嫩和爱尔兰也有肺炎克雷伯菌携带NDM-1耐药基因的报道.　　二、检测方法　　1.表型确证试验　　由于MBLs活性对锌离子具有依赖性，所以目前所有产MBLS菌株的表型确证试验都是基于EDTA或2_琉基丙酸(2-MPA)等金属离子鳌合剂能抑制该酶活性这一特点而设计的，包括E一试验、双平板增效试验、组合纸片法等。陶晶等报道这3种试验的敏感性除了组合纸片法(以直径之差)7~为标准以外，均为100%，但特异性以E一试验和组合纸片法为最高，均为100%，双纸片协同试验最低，只有91.3%。(1)E一试验:根据IMP或头抱他陡在2-MPA或　EDTA存在时细菌MIC值的减少，并用多种E一试验浓度梯度来检测MBLs的产生。Maria等“用E_试验对MBLs进行筛选，MIC比率(仅含亚胺培南的MIC与同时含有亚胺培南和EDTA的MIC之比),8判定为阳性，即为产MBL、菌株。(2)双平板增效试验:使用较多的抗生素是亚胺培南、美罗培南和氨节青霉素，金属离子鳌合剂较常用EDTA和2-MPAoJohann等，一在含10ug亚胺培南或美罗培南的琼脂平板中加人5uL0.5mol/LEDTA，不含EDTA的亚胺培南或美罗培南的琼脂平板做对照，含EDTA的平板较不含EDTA平板的抑菌圈增加7~或以上判定为阳性。用亚胺培南双平板增效试验特异性为91%，灵敏度为%%，用美罗培南双平板增效试验特异性为97，灵敏度为100%(3)组合纸片法:Galani等〔?6l认为头袍他陡和1900或750}gEDTA的组合纸片法具有最高的灵敏度(97.9%一100%)和特异性(87.9%一96.0%。亚胺培南与1900figEDTA的敏感性(94.7%)和特异性(98.0%)非常好。亚胺培南+0.5mol/LEDTA或头饱他陡+0.2mol/LEDTA的组合纸片法和1900PgEDTA与位于10~外亚胺培南的双平板增效试验是肠杆菌科检测MBLs最有效的方法。(4)其他方法:Castanheira等[z}}通过对MBLs活性的测定从而证实MBLs存在过夜培养细胞经超声处理获得粗提物，以150}mol/L亚胺培南和美罗培南为酶作用底物，一个反应体系加人25mmol/LED-TA，一个反应体系不加EDTA，用分光光度计测定在299~波长处两个反应体系吸光度的改变以确定酶活性能否被金属鳌合剂抑制，能抑制则表明存在MBLs以上几种方法为MBLs的表型检测常见筛选方法，采用上述系列方法对耐药的肺炎克雷伯菌进行遴选，均可得到研究所需要的产MBLs菌株。　　2.接合试验　　接合试验主要用于检测菌株MBLs基因的转移。　　Pagani等用MH琼脂平板进行接合试验，他们用MKD-1235大肠埃希菌或铜绿假单胞菌10145/3扒TCC10145菌株的rpoB衍生物)作为接合试验的受体菌，初期供体菌和受体菌的比例为0.1，接合平板置于37℃培养7h，大肠埃希菌转移接合子用含4}g/mL的头饱他陡和300,ug/mL利福平的MH琼脂平板进行筛选，铜绿假单胞菌转移接合子用含4}c剔mL的亚胺培南和300,ug/mL利福平的MH琼脂平板进行筛选。　　3.PCR及核酸序列分析　　PCR及核酸序列分析是MBLs的确证试验。　　Mari等,介绍的PCR扩增过程为:首先将细菌培养物在]100川」蒸馏水中煮沸10min制备基因组DNA,PCR反应体系为1}L细菌混悬液、20irnnol/LTris-HC1(pH8.4)，mrnol/LKCl，200;}mol/LdNTP,2.0nmml/L'V1gi退,V}VI上游引物:3'-GGCATCCAAGCAGCAAG-5'，下游引物:3'-AAGCAGACTIGACCTGA一5'，各25pmol/L及1UTaqDNA聚合酶,94℃预变性10min,940C变性1min,540C退火1min,72℃延伸2.5min,30个循环，最后再延伸10min0PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳、嗅化乙锭染色进行检测:三、结语产MBIs肺炎克雷伯菌已表现出多重耐药性，而且获得性金属酶基因常位于整合子等可移动的基因元件上，且耐药谱呈现扩大迹象。如何建立一种简便、可靠、快速的检测MBLs的方法，有效预防耐药菌的传播扩散，更好地指导临床合理用药，是目前函待解决的难题，值得进一步研究。　　参考文献     Liaw YF,Chu CM. 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