强制泛素化HBcAg融合基因重组慢病毒对小鼠体内细胞毒性T细胞的诱导作用
发表时间：2014-08-15 浏览次数：1236次
HBV特异性的细胞毒性T细胞(CTL)在清除HBV，特别是在清除肝细胞内cccDNA的过程中发挥关键作用。慢性HBV感染者体内产生的特异性CTL反应非常弱，在其外周血中分离出来的HBV特异性CTL增殖能力低下，有效地诱导HBV特异CTL反应已成为治疗慢性乙型肝炎的关键。本实验在前期体外实验的基础上，利用慢病毒载体介导强制泛素化HBcAg(LV-Ub-HBcAg)对小鼠体内的CTL反应进行初步研究，探讨抗原泛素化修饰后在诱导细胞免疫应答中的作用，为慢性乙型肝炎治疗提供新的研究思路和实验基础。 材料与方法 一、材料及来源 人胚肾细胞株293T细胞由本实验组购买并保存，大肠埃希菌DHSa购自TIANGEN公司，慢病毒载体质粒、辅助质粒由上海锐赛生物公司提供，Lipo-fectamine200()转染试剂盒购自Invitrogen公司，鼠抗人HBcAg单克隆抗体购自SANTACRUZ公司。小鼠淋巴细胞分离液购于北京康贝源科技有限公司，CCK-8试剂盒、细胞固定剂和破膜剂均购自同仁化学研究所，佛波酚、离子霉素和莫能霉素均购自Sig-ma公司，PE标记抗小鼠IFN-y单克隆抗体和FITC标记抗小鼠CD8a抗体均购自eBioscience公司。BALB/c小鼠,6一8周，雌性，22一26g,SPF级，由上海生命科学研究院斯莱克实验动物有限公司提供，在上海市第六人民医院实验中心清洁级条件下饲养。 二、方法 1.重组慢病毒包装及表达 将漫病毒载体质粒pLenti6.3-IRES-EGFP,pLen-ti6.3-Ub-HBcAg和pLenti6.-HBcAg、包装质粒1pGag/Pol,包装质粒2pRev、包膜质粒pVSVG，按照POLOdelivererTM3000转染试剂的使用说明按次序进行混匀，形成DNA与POLOdeliverer}3000Transfec-tionReagent的复合物。将混合液均匀地滴加在293T细胞培养液中，充分摇匀，于37℃，5%C姚细胞培养箱中培养。收集48h,72h的细胞上清液，于4℃，3000r/m(离心半径6cm)离心10min，离心后除去细胞碎片。用0.45um醋酸纤维素膜过滤上清液，4℃22000r/m(离心半径10cm)离心2h，弃上清，PBS溶解沉淀，溶解完全后收集至1.5mLEP管内后，100}L/管分装，-80℃保存。用含病毒悬液感染293T细胞，MOI为1-3，收集细胞用免疫印迹法(Western法)检测。 2.小鼠免疫程序 选取近交系同等条件的Balb/c小鼠32只，分为磷酸盐缓冲液组(PBS组))4只、LV组4只、HBcAg重组慢病毒(LV-HBcAg)组12只、Ub-HBcAg融合基因重组慢病毒(LV-Ub-HBcAg)组12只。PBS组小鼠尾根部皮内注射PBS200}L，其余3组均注射200}.L含慢病毒或重组慢病毒2x1口拷贝的PBS混悬液。1周后，每组各取半数小鼠提取T细胞进行实验，剩余小鼠用于二次免疫。二次免疫2周后，将小鼠全部处死，提取T细胞。 3.脾淋巴细胞的制备 将Balb/c小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下切开小鼠皮肤及腹膜，取出脾脏;在尼龙网上用眼科剪剪碎，用注射器活塞轻轻研磨，同时吸取PBS冲洗，使单个细胞透过尼龙膜到培养皿中得到脾细胞悬液;将细胞悬液加人提前预热好的淋巴细胞分离液的上层，2200r/m(离心半径6cm)离，L}20min，离心后吸出第2层，即淋巴细胞层;用PBS将吸出的淋巴细胞洗涤2次后，用RPMI-1640培养液重悬，即得到混合淋巴细胞悬液。 4.T细胞分离 用20mL无血清RPMI-1640培养基平衡T细胞尼龙柱，后加人巧mL含血清的培养基，关闭弹簧夹;加人混合好的淋巴细胞悬液约2mL左右，打开弹簧夹，再加人少量培养基约1mL，关闭弹簧夹;用锡箔纸覆盖后，放人培养箱中静置45一60min;取出柱子，打开弹簧夹，向柱子里缓慢加入20mL含血清的RPMI-1640培养基，控制流速在3一4mL./min，流出大约5mL后，开始收集细胞悬液，收集约1个柱子的体积时停止。 5.增殖T细胞胞内细胞因子的检测 将各组分离所得的T细胞以RPMI-1640调整至1x106/mL，加人25}g/mL佛波醋,1.7}.留mL莫能霉素和1}g/mL离子霉素，37℃,5%COZ孵育6h;收集细胞用PBs洗涤2次后，取100}L细胞悬液，加人FTTC-CDBa抗体，避光标记染色15min，加PBS洗涤2次，参照固定/破膜试剂说明书，用100}L固定剂作用15min，然后用PBS洗涤，再用100}L破膜剂作用5min;向其中直接加PE一工FN一丫抗体，然后室温避光孵育30min;加PBS洗涤2次后，用soo}LPBs重悬，用流式细胞仪对细胞荧光进行检测分析。 6.T细胞增殖反应 调整T细胞浓度至1x1护/mL，接种于孔板，每孔加人loouL细胞悬液和100,aL刀豆素A溶液，每组设3复孔。将%孔板放在37℃,5%CO:培养箱中44h;取出%孔板向各孔中加CCK-8试剂10}L,37℃下孵育4h，用酶标仪检测450nm波长的A值。 7.增殖的T细胞分泌的细胞因子检测 将T细胞收集后，调整细胞密度为1x10'/mL,放于6孔板中，每孔1mL,370C,5%CO:培养箱中培养4d后，收集上清液，-20℃保存待用;用ELISA试剂盒进行检测，检测培养上清中IL-2,IFN-y,IL-4和IL-10的水平。 三、统计学分析 采用SPSS16.0软件进行分析，实验所得数据以x1、表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。 结果 一、重组慢病毒的包装及表达1.重组慢病毒质粒共转染和转染293T细胞293T细胞转染72h后在荧光倒置显微镜下可见到绿色荧光蛋白表达;将收集好的重组慢病毒液按照MOI为1-3感染293T细胞，48h可见明亮的绿色荧光蛋白表达(见封三图)。 2.重组慢病毒感染293T细胞后HBcAg的表达 重组慢病毒感染293T细胞后，Western印记检测结果显示目的蛋白HBcAg在对照组LV-HBcAg中表达明显，而在LV-Ub-HBcAg中表达不显著，见图2。推测是由于抗原经泛素化修饰后，泛素蛋白酶体系统对抗原蛋白的降解作用加强，蛋白表达量降低。 二、重组慢病毒免疫后T细胞检测结果 1.增殖T细胞胞内细胞因子检测结果流式细胞仪结果显示，初次免疫后LV-Ub-HBcAg刺激产生的CTL数目高于LV-HBcAg组及其他各组，LV-Ub-HBcAg组与LV-HBcAg组比较差异有统计学意义(t二2.30,P<0.05);LV-HBcAg组与LV组比较差异有统计学意义(t=2.33,P<0.05)，见图3。 2.T细胞增殖反应重组慢病毒免疫小鼠后，刺激小鼠体内T细胞活化和增殖，用CCK-8试剂盒检测各组的Aasona,值。 结果可见，LV-Ub-HBcAg组增殖的细胞数与LV-HBcAg组比较差异有统计学意义(t=2.25,P<0.05);LV-HBcAg组与LV组比较差异也有统计学意义(t=2.42,P<0.05)。详见图4。 3.增殖T细胞细胞因子分泌水平ELISA检测结果，免疫后LV-Ub-HBcAg组可以明显上调细胞免疫型Thl细胞类细胞因子IEN-y,IL-2的分泌，而对体液免疫型Th2细胞类细胞因子IL-4和IL-10的分泌没有明显的促进作用，详见表1. 讨论 慢性HBV感染者体内产生的特异性细胞免疫应答不足，特别是清除HBV的CTL数量不足，导致病毒清除受限持续存在。在真核细胞中，抗原蛋白是在泛素蛋白酶体系统(UPS)的作用下完成底物的多聚泛素化，进而被蛋白酶体复合物识别和降解[3]0已有实验证实将抗原蛋白强制泛素化能够促进UPS将抗原蛋白快速降解成最适长度的表位肤，提高抗原提呈效率，从而诱导更强的特异性CTL免疫应答。 慢病毒载体已成为目前广泛使用的生物载体，具有容量大(可最多容纳8kb)、转染率高(可转染分裂细胞和非分裂细胞)、免疫性低、突变性低和表达持久等优势，是感染性疾病抗原和肿瘤抗原诱导有效细胞免疫和体液免疫的最佳疫苗载体。 本实验通过将抗原蛋白HBcAg强制泛素化，构建携带融合基因的慢病毒载体，并直接用重组慢病毒免疫小鼠，使HBcAg能够在UPS的作用下迅速降解为最适长度的表位肤，与MHC-I类分子结合后提呈，诱导HBV特异性CTL反应。流式细胞仪检测结果提示，慢病毒载体免疫后诱导了小鼠体内的免疫应答，实验组LV-Ub-HBcAgT细胞胞内分泌的细胞因子高于对照组LV-HBcAg的分泌水平，诱导的CTL数量水平更高，说明泛素化抗原能够促进抗原诱导更强的特异性细胞免疫应答。活化的T细胞能够分泌IFN-y,IL-2,IL-4和IL-10等细胞因子，通过检测细胞因子的分泌水平能够反映T细胞的活化水平及免疫应答水平。ELISA法检测结果提示，在慢病毒载体免疫小鼠后，LV-Ub-HBcAg组可以明显上调细胞免疫型Thl细胞类细胞因子IFN-y,IL-2的分泌，而对体液免疫型Th2细胞类细胞因子IL-4、和IL-10的分泌没有明显的促进作用，说明抗原泛素化后更易促进细胞免疫应答，能够更有效地刺激T细胞，尤其是Thl细胞，提高其分泌细胞因子的水平。CCK-8增殖试验结果说明泛素化修饰抗原后能够促进T细胞的增殖，促进免疫应答。 本文结果表明，对抗原进行强制泛素化修饰能够促进抗原蛋白的降解及提呈，经慢病毒载体介导后，能够诱导小鼠体内特异性的CTL反应，提高免疫应答水平，这一结论为慢性乙型肝炎治疗的研究提供了一定的实验基础。 参考文献 Kim Y,Jeong KS,Song HJ. 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