糖基化终产物通过PI3k/Akt信号通路诱导肾小管上皮细胞转分化

　　作者：黄晓霞1, 柯昌斌2, 张建鄂1, 丁国华3 作者单位：(郧阳医学院附属太和医院1肾病内科,2麻醉科, 湖北 十堰 442000;3武汉大学人民医院肾内科, 湖北 武汉 430071)

　　【摘要】 目的:观察PI3k/Akt信号通路在糖基化终产物(AGEs)诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法:大鼠肾小管上皮细胞随机分为对照组(C组)，糖基化终产物组(D组)和PI3K抑制剂组(W组)。D、W组加入AGEBSA(100mg·L1); W组在AGEBSA处理前用PI3K抑制剂预处理1h。加AGEBSA 1,6,12,24,48 h时用免疫细胞化学和Western blot检测αSMA和pAkt的表达。结果: D组αSMA在6 h时出现阳性表达，24 h达高峰;pAkt在1h出现阳性表达，12 h达高峰，48 h开始下降。结论: PI3k/Akt信号转导系统触发了糖基化终产物诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化。

　　【关键词】 PI3k/Akt;肾小管;上皮细胞;细胞分化;糖尿病肾病

　　Role of PI3k/Akt Signal Pathway in Renal Tubular Epithelial Cell Transdifferentiation Induced with Advanced Glycation EndProducts HUANG Xiaoxia1,KE Changbin2,ZHANG Jiane1,DING Guohua3 (1Department of Nephrology,2Department of Anesthesiology,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;3Department of Nephrology,School of Medicine,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430071,China)

　　Abstract:Objective To investigate the role of PI3k/Akt signal pathway in renal tubular epithelial cells transdifferentiation induced with advanced glycation endproducts(AGEs).Methods Rat renal tubular epithelial cells were randomly divided into control group,AGEs group and wortmannin group.Wortmannin group was pretreated with wortmannin for one hour before administration of AGEBSA,and then AGEs group and wortmannin group were both treated with AGEBSA(100mg/L).At 1,6,12,24 and 48 hour,phosphorylation of Akt and expression of αSMA were determined by immunocytochemistry and Western blot,respectively.Results The positive expression of αSMA protein was observed at 6h in AGEs group,and reached a peak at 24h.The positive expression of pAkt was observed at 1h,then reached the peak at 12h,and began to decrease at 48h.Conclusions PI3k/Akt signal pathway may stimulate the transdifferentiation of renal tubular epithelial cells induced with advanced glycation endproducts.

　　Key words:PI3k/Akt;Renal tubular;Epithelial cell;Cell Differentiation;Diabetic Nephropathy

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病的常见并发症之一,发病率逐年上升,并成为终末期肾衰竭危及患者生命的重要原因。DN时肾间质纤维化则是终末期肾衰竭的必然病理过程，而来源于肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation,TEMT) 的肌成纤维细胞(Myof)大量增生及活化是肾间质纤维化的根本原因和中心环节[12]。糖基化终产物(AGEs)在糖尿病肾纤维化进展中有重要作用，但AGEs是否参与TEMT及其分子机制不明。PI3K/Akt信号通路的激活可能是一个必不可少的步骤[38]。本课题拟研究PI3K/Akt信号通路在糖基化终产物诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂

　　大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)购于ATCC;平滑肌肌动蛋白(αSMA)单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，磷酸化Akt(pAkt)单克隆抗体、PI3K抑制剂Wortmannin (上海康成生物工程有限公司)，αSMA免疫细胞化学用二抗、pAk t免疫细胞化学用二抗、Western blot用HRP标记二抗 (北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2 细胞培养及分组

　　用含5%胎牛血清的DMEM培养基，在5%CO2、37℃的条件下培养NRK52E。将细胞随机分成三组(n=8)：对照组(C组)，糖基化终产物组(D组)和PI3K抑制剂组(W组)。细胞同步化处理后，C组加入牛血清清蛋白(BSA)(100 mg·L1);D组加入AGEBSA(100 mg·L1); W组用PI3K抑制剂预处理1 h后，加入AGEBSA(100 mg·L1)。

　　1.3 αSMA及pAkt的测定

　　4℃下用4%多聚甲醛固定细胞10 min，3%H2O2处理10 min，10%羊血清封闭10 min，一抗4 ℃下孵育12 h后加二抗室温孵育2 h,DAB显色。镜下观察αSMA和pAkt的阳性表达情况。分别于糖基化终产物处理1，6,12,24,48 h时检测αSMA和pAkt的表达情况。随机取5个视野，计数每个视野阳性细胞百分比 (阳性细胞百分比=该视野阳性细胞数/该视野总细胞数×100%)。

　　BCA蛋白定量法测定蛋白质浓度，按照蛋白质抽提试剂盒说明进行蛋白提取。10%SDSPAGE电泳，转膜3 h后加入pAkt 一抗，4℃下孵育12 h，加二抗室温下孵育2 h，DAB显色10 min。用图象分析软件imagepro plus 6.0对目标条带进行测定，以目标条带积分光密度值(IOD)做为pAkt相对表达量。

　　1.4 统计学处理

　　计量资料结果用均数±标准差表示(x±s), 采用多因素方差分析。用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　表1 不同时间点αSMA表达阳性细胞百分比比较注：与C组比较，*P<0.05表2 不同时间点pAkt表达阳性细胞百分比比较 (%,x±s, n=8)表3 不同时间点pAkt的积分光密度值(IOD×104)比较(%,x±s, n=8)注：与C组比较，* P<0.05; 与24 h比较，# P<0.05

　　αSMA阳性表达是胞浆中出现黄褐色呈纺垂形或放射状分布丝状物。C组和W组各时间段内均只见少数可疑阳性细胞，D组6 h出现阳性表达，24 h达高峰。(见表1,图1～4)

　　pAkt阳性表达为细胞的胞核呈深黄褐着色。C组和W组各时间段内均只见少量可疑阳性细胞，D组从1 h出现阳性表达，12 h达高峰，48 h开始下降。(见表2，图5～8)。

　　表3示D组pAkt的积分光密度值均高于C组和W组，且12 h达高峰，48 h开始下降。

　　3 讨 论

　　转分化是指细胞在病理情况下失去其特有的表型后获得新的表型而转化为另一种细胞的过程。正常情况下肾小管上皮细胞不表达αSMA，但在病理状态下各种损伤刺激均可启动TEMT，肾小管上皮细胞可转化为Myof，并表达间质细胞的标志蛋白αSMA。故以αSMA作为肾小管上皮细胞转分化的标志，只要细胞中发现αSMA，无论其表达量的多少，均可认为细胞发生了转分化。此时细胞极性消失，细胞间及细胞与基质间的连接结构消失，细胞骨架蛋白重塑，细胞移行及侵袭能力均增强，同时具有十分活跃的增殖和分泌细胞外基质的功能，这些改变都直接参与了肾间质纤维化的发生和发展。转分化中形成的Myof是间质中合成细胞外基质的主要细胞，Myof数目的多少直接决定了肾间质纤维化病变的程度及纤维化进展的速度。

　　AGEs是在非酶促条件下,蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的稳定终末产物，在糖尿病肾病的发生和发展中有重要作用。本实验证实了糖基化终产物剌激肾小管上皮细胞会引起TEMT，且PI3K抑制剂可明显抑制糖基化终产物诱导的肾小管上皮细胞转分化，证明PI3K的激活是糖基化终产物诱导肾小管上皮细胞转分化的必要条件。

　　PI3K/Akt信号通路的活化是糖基化终产物诱导的肾小管上皮细胞转分的必要条件;且Akt磷酸化与转分化均达高峰时,发生Akt磷酸化的肾小管上皮细胞数与发生转分化细胞数相当，但转分化的高峰期滞后于Akt磷酸化的高峰期。即PI3K/Akt信号通路的激活是早于转分化的，那么从生物学行为上认为PI3K/Akt信号通路介导了糖基化终产物诱导的肾小管上皮细胞转分是合理的。因此认为PI3K/Akt信号通路在糖基化终产物诱导的肾小管上皮细胞转分化有非常重要的作用，特异性地抑制PI3K/Akt信号通路可能是DN时肾纤维化防治的一个新思路。

　　Akt的磷酸化过程仅发生在糖基化终产物剌激的早期，后期Akt磷酸化水平逐渐下降，但转分化细胞的数目并不下降，说明PI3K/Akt信号通路只参与TEMT的诱发过程，而肾小管上皮细胞一旦转分化获行新的表型和功能后，将不再依赖于PI3K/Akt信号通路而持继存在。这说明转分化一旦发生后将不再依赖于原发力量而将持续发展，这也可能是临床中发现一旦肾脏开始出现纤维化后，再进行严格控制血糖并不能有效阻止糖尿病肾病肾纤维化进程的主要原因。DM时早期阻断PI3K/Akt信号通路可能对防止DN时肾间质纤维的发生有重要意义，而一旦肾脏开始出现纤维化，再阻断PI3k/Akt信号通路可能对防止DN时肾纤维化的作用意义并不明显，因此应早期通过PI3k/Akt信号通路的调控来防治DN肾纤维化，从源头上切断转分化的发生。

　　(文中图1～8见封三)

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