羟苯磺酸钙对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

　　作者：王黎萍1,2, 沈建明2, 叶婷婷2, 曹书芬3, 田 林3, 田少江2, 李骏峰2, 丁国华1* 作者单位：(1武汉大学附属人民医院肾内科,湖北 武汉 430037; 郧阳医学院2附属人民医院肾内科, 3病理科，湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的：评价羟苯磺酸钙对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化影响, 并探讨其作用机制。方法: 21只SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、肾间质纤维化组(UUO组)及羟苯磺酸钙组(CDT组)，分别采用病理及免疫组织化学方法观察UUO术后14 d大鼠梗阻侧肾脏的组织学变化和MMP-9、TIMP-l表达情况。结果：与Sham组相比，UUO组大鼠肾间质纤维组织面积显著增加(P<0.01)，MMP-9、TIMP-1表达均有显著增高(P<0.01)。与UUO组相比,CDT组大鼠肾间质纤维组织面积减少，MMP-9表达增强、TIMP-1表达减弱(P<0.01)，UUO组和CDT组大鼠左肾MMP-9/TIMP-1与肾间质纤维化面积成负相关，且有统计学意义(P<0.01)。结论：羟苯磺酸钙可缓解输尿管梗阻导致的肾间质纤维化，其机制可能与其调节MMP-9/TIMP-1紊乱、改善基质代谢有关。

　　【关键词】 羟苯磺酸钙;肾间质纤维化;单侧输尿管梗阻

　　Protective Effect of Calcium Dobesilate on Renal Interstitial Fibrosis in Rats with Unilateral Ureteral Obstruction WANG Li-ping1,2, SHEN Jian-ming2, YE Ting-ting2, CAO Shu-feng3, TIAN Ling3, TIAN Shao-jiang2, LI Jun Feng2, DING Guo-hua1 (1Department of Nephorology,Renmin Hospital,Wuhan　University, Wuhan,Hubei 430070, China; 2Department of Nephorology, 3Department of Pathology, Renmin Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, Hubei 442000, China)

　　Abstract: Objective To assess the effects of calcium dobesilate on renal interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstruction(UUO) rat model and to explore its possible mechanisms. Methods Twenty-one SD rats were randomly divided into three groups: the Sham group，the UUO group，and the calcium dobesilate treated(CDT) group. UUO model was established by ligating the left ureters of rats. Fourteen days later，renal pathological changes were analyzed by HE and Masson staining, and immunohistochemistry staining was used to observe the expression of MMP-9 and TIMP-1. Results Fibrosis was observed in the renal interstitium of rats with obstructive nephropathy compared with the sham group (P<0.01). The expressions of MMP-9 and TIMP-1 in UUO group were up-regulated in the renal tubular epithelial cells and renal interstitial cells than that in the Sham group. In CDT group, histopathologic changes were ameliorated, the expression of TIMP-1 was down-regulated, and the expression of MMP-9 was up-regulated, compared with UUO group, respectively (P<0.01). There was a negative correlation between the areas of fibrosis and the ratios of MMP-9/TIMP-1 for rats both in UUO group and CDT group (P<0.01). Conclusion Calcium dobesilate could attenuate renal interstitial fibrosis by improving imbalance of the expression of MMP-9/TIMP-1 in UUO rats.

　　Key words: Calcium dobesilate; Renal interstitial fibrosis; Unilateral ureteral obstruction

　　肾间质纤维化(renal interstitial fribrosis，RIF)是慢性肾脏病进展到终末期肾衰竭的共同途径的最终组成部分，在慢性肾脏病进展中有决定性作用[1]。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)积聚是RIF主要机制之一。ECM积聚除与其合成增加有关，还与其降解减少相关。基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases, MMPs) 是ECM的主要降解酶之一，MMPs的活性受金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)所抑制。MMPs/TIMPs降低是RIF过程中ECM积聚的主要原因[2]。

　　治疗RIF目前尚无理想的药物。羟苯磺酸钙是一种微血管保护药，可以改善慢性肾脏病的肾功能不全，对糖尿病肾病状态下肾小球细胞外基质的沉积有减轻作用[3]。但有关羟苯磺酸钙防治RIF的研究却未见报道，因此我们采用单侧输尿管梗阻建立大鼠RIF模型，观察羟苯磺酸钙对大鼠肾间质纤维化是否有保护作用并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠21只, 体重200～220 g，购于郧阳医学院动物实验中心。

　　1.2 试剂和配置

　　羟苯磺酸钙胶囊(calcium dobesilate，商品名：多贝斯，西安利君制药有限公司)。免疫组化染色试剂盒：兔抗大鼠TIMP-1抗体、MMP-9抗体，SABC试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3 实验方法

　　采用左侧输尿管双重结扎并离断术制备大鼠肾间质纤维化模型。

　　实验分组设计方案：随机分为假手术组(Sham组)、肾间质纤维化组(UUO组)及羟苯磺酸钙组(CDT组)，每组7只。UUO组和CDT组行左侧输尿管结扎并离断术，Sham组除不结扎及离断左侧输尿管外其余操作相同。手术当天开始治疗，CDT组按120 mg·kg-1·d-1予以羟苯磺酸钙灌胃，Sham组和UUO组按5 ml·kg-1·d-1予以蒸馏水灌胃(参考临床剂量和药理实验方法学)。

　　肾脏的病理组织学观察：于术后14 d处死大鼠，留取左肾标本分别行HE染色和Masson染色。参考Taal等[4]的方法，在光镜下随机选择HE染色组织切片中l0个不含肾小球的连续不重复视野(×200倍)，对肾小管间质病变进行半定量评分。采用HPIAS-1000彩色病理图文报告分析系统在Masson染色下分析肾间质纤维化面积，每张切片选取10个连续不重复的视野，取其平均值。

　　肾组织MMP-9和TIMP-l免疫组织化学染色：SABC法染色后，采用HPIAS-1000彩色病理图文报告分析系统分析免疫组化染色阳性细胞积分光密度值(integral optical density, IOD)，每张切片选取10个连续不重复的视野，取其平均值。

　　1.4 统计学处理

　　计量资料采用均数±标准差(x±s)描述。依据数据的性质，采用单因素方差检验和Kruskal-Wallis秩和检验行组间差异检验，相关分析采用等级相关。使用Stata 7.0软件包行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 HE、Masson染色观察

　　Sham组：肾小球及肾小管基本正常。UUO 组：见肾间质水肿，炎症细胞浸润，肾小管明显扩张，部分肾小管呈灶状萎缩，部分间质纤维化，但肾小球未见明显病变(图1)。CDT 组：病理改变较UUO组轻，胶原成分有所减少，纤维化程度减轻。

　　2.2 三组大鼠左肾肾间质损伤半定量评分及肾间质纤维化面积比较

　　见表1。UUO组肾间质损伤评分及肾间质纤维化面积均较Sham组增加(P<0.01);CDT组肾间质损伤评分及肾间质纤维化面积较UUO组减少，但较Sham组增加，其差异均有显著的统计学意义(P<0.01)。表1 各组大鼠左肾间质损伤半定量评分及肾间质纤维化面积比注：与Sham组相比，▲P<0.01;与UUO组相比，▼P<0.01

　　2.3 各组大鼠左肾MMP-9、TIMP-1变化

　　见表2。Sham组肾小管上皮细胞胞浆有少量MMP-9、TIMP-1表达，肾小球和肾间质细胞少见。MMP-9在UUO组呈阳性表达(图2)，IOD比Sham组升高(P<0.01);CDT组较UUO组表达更明显，IOD较UUO组高(P<0.01)。TIMP-1在UUO组呈阳性表达(图3)，IOD水平较Sham组高(P<0.01);CDT组较UUO组表达减弱，IOD较UUO组低(P<0.01)。表2 各组大鼠左肾MMP-9、TIMP-1的IOD比较　注：与Sham组相比，△P<0.05，▲ P<0.01;与UUO组相比，▼ P<0.01

　　2.4 UUO组和CDT组大鼠左肾MMP-9/TIMP-1与间质纤维化面积的相关性

　　经相关分析，在术后14 d，UUO组和CDT组大鼠左肾MMP-9/TIMP-1与肾间质纤维化面积成负相关(rs=-0.9077)，有统计学意义(P<0.01),见图4。

　　图4 MMP-9/TIMP-1与间质纤维化面积的相关性

　　3 讨论

　　肾间质纤维化在慢性肾脏病进展中具有决定性作用。UUO模型是一种理想的研究肾间质纤维化的动物模型。本实验结果也显示：在输尿管梗阻后可见肾小管结构破坏，小管萎缩，管腔塌陷，上皮细胞大量坏死，肾间质炎性细胞浸润明显，肾间质损伤评分增加，肾间质纤维化面积增大，而肾小球无明显变化，这与文献报道相符[5]。有报导凡是有ECM增多的肾脏疾病均有TIMPs高表达或MMP/TIMP比例降低，提示MMP/TIMP比例降低，即MMP/TIMP失衡是导致肾间质纤维化的重要原因[6]。

　　MMP-9又称胶原酶B，主要降解ECM中Ⅳ型胶原。通常认为MMP-9是具有抗纤维化作用的“保护性”物质，其表达下调与非炎症性肾病进展及ECM积聚有关[7]。但我们发现，UUO组MMP-9在肾小管中表达并未减少，反而较Sham组增加，考虑与其在梗阻早期作为前炎症介质高表达有关[8]。而UUO组肾间质纤维化并未减轻的原因可能为：①MMP-9前体蛋白的激活减少;②由于高表达TIMP-1抑制其降解ECM的能力。肾组织TIMP-1主要是由肾脏固有细胞、巨噬细胞及成纤维细胞产生的一种糖蛋白，它能特异性抑制MMP-9活性，从而使MMP-9失去降解ECM能力，TIMP-1过度表达是导致RIF的主要原因之一[9]。

　　生理状态下，MMP-9和TIMP-1保持平衡状态，病理状态下这种平衡状态被打破。本研究结果显示，在RIF的大鼠模型中，肾小管上皮细胞、间质MMP-9表达升高，TIMP-1表达量明显增加，MMP-9/TIMP-1与肾间质纤维化面积呈显著负相关，提示MMP-9/TIMP-1失衡是导致ECM降解减少和肾间质纤维化的重要原因，而给予羟苯磺酸钙干预后，病理改变减轻，肾间质损伤评分下降，可见MMP-9表达增加和TIMP-1表达下降。提示羟苯磺酸钙可以通过增加MMP-9表达、抑制 TIMP-1表达、改善MMP/TIMP失衡，降低ECM在肾间质的过度沉积，减轻肾间质纤维化程度，从而起到肾脏保护作用。

　　(文中图1～3见封四)

　　【参考文献】

　　[1]Nangaku M.Mechanisms of tubulointerstitial injury in the kidney:final common pathways to end-stage renal failure[J].Intern Med,2004, 43(1):9-17.

　　[2]Zeisberg M,Maeshima Y,Mosterman B,et al.Renal fibrosis:extracellular matrix microenvironment regulates migratory behavior of activated tubular epithelial cells[J].Am J Pathol,2002,160(6):2 001-2 008.

　　[3]董骏武,刘晓城,刘慎微,等.羟苯磺酸钙对糖尿病大鼠肾小球MMP 9/TIMP 1的影响[J].临床内科杂志,2005,22(6):419-421.

　　[4]Taal MW,Zandi-Nejad K,Weening B,et al.Proinflammatory gene expression and macrophage recruitment in the rat remnant kidney[J].Kidney Int,2000,58(4):1 664-1 676.

　　[5]Liu FY,Li XZ,Peng YM,et al.Arkadia-Smad 7-mediated positive regulation of TGF-beta signaling in a rat model of tubulointerstitial fibrosis[J].Am J Nephrol,2007,27(2):176-183.

　　[6]Liu Y,Rajur K,Tolbert E,et al.Endogenous hepatocyte growth factor ameliorates chronic renal injury by activating matrix degradation pathways[J].Kidney Int,2000,58(5):2 028-2 043.

　　[7]Docherty NG,O'Sullivan OE,Healy DA,et al.Evidence that inhibition of tubular cell apoptosis protects against renal damage and development of fibrosis following ureteric obstruction[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(1):F4-13.

　　[8]Marti HP.Role of matrix metalloproteinases in the progression of renal lesions[J].Presse Med,2000,29(14):811-881.

　　[9]Chevalier RL.Pathogenesis of renal injury in obstructive uropathy[J].Curr Opin Pediatr,2006,18(2):153-160