曲尼司特对结缔组织生长因子刺激人肾小管上皮细胞胶原Ⅳ合成的影响

　　作者：白寿军1,2, 张 永2, 张建鄂2, 徐 钢1*, 刘晓城1 作者单位：(1华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科,湖北 武汉 430030;2郧阳医学院附属太和医院肾内科,湖北 十堰 442000)

　　【摘要】 目的:研究曲尼司特(Tran)对重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)刺激人肾小管上皮细胞(HKCs)胶原Ⅳ合成的影响，以探讨其抗肾小管间质纤维化的机制。方法:将培养的HKCs分为三组：⑴对照组;⑵rhCTGF(20 ng/mL)干预组;⑶rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组。MTT法检测Tran对HKCs的毒性，用倒置显微镜观察细胞形态的变化，用RTPCR方法评价胶原Ⅳα1 mRNA的表达改变，用免疫荧光镜和Western Blotting方法评价胶原Ⅳα1蛋白的表达水平。结果:rhCTGF刺激48 h后，HKCs由正常的卵圆形变为梭形，细胞内胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白的表达均明显增高(P<0.05)，而rhCTGF+Tran干预组，HKC大部分为卵圆形，部分仍为梭形，胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:曲尼司特可能通过抑制CTGF诱导的细胞外基质的合成，从而减轻肾纤维化，发挥其肾脏保护作用。

　　【关键词】 曲尼司特;结缔组织生长因子;肾小管间质纤维化;胶原

　　Effect of Tranilast on CollagenⅣ Synthesis in Human Renal Tubular Epithelial Cells Induced with Connective Tissue Growth Factor BAI Shoujun1,2,ZHANG Yong2,ZHANG Jiane2,XU Gang1*,LIU Xiaocheng1 (Department of Nephrology,1Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030;2Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract:Objective To study the effect of tranilast on collagen Ⅳ synthesis in human renal tubular epithelial cells induced with connective tissue growth factor,and to explore its antifibrosis mechanism on renal tubular interstitial fibrosis. Methods The cultured HKCs were divided into three groups: ⑴control group;⑵ the rhCTGF(20 ng/mL)intervention group;⑶ the rhCTGF(20 ng/mL)and Tran(100 μmol/L)intervention group.The cytotoxicity of Tran on HKCs was determined with MTT assay,the cell morphological changes were observed by inverted microscope,the expression of collagen Ⅳα1 were detected with immunofluorescence and Western Blotting.Results When HKCs were stimulated with rhCTGF for 48 h, the appearances of HKCs were changed from normal oval to fusiform, the expression of collagen Ⅳα1 mRNA and protein were significantly increased(P<0.05).However,the majority of HKC cells were oval and part of them were still fusiform in CTGF and Tran intervention group,the mRNA and protein expression of Collagen Ⅳα1 were significantly decreased (P<0.05). Conclusion Tranilast could inhibit the synthesis of extracellular matrix induced with CTGF,and thereafter relieve renal fibrosis and protect renal function.

　　Key words:Tranilast;Connective tissue growth factor;Renal tubular interstitial fibrosis;Collagen

　　肾小管间质约占肾脏体积的90%，如果受到损害会引起肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)、细胞外基质(ECM，包括纤连蛋白、胶原Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ)的沉积，TIF是各种肾脏疾病进展的决定性因素[1]。作为小管间质的固有细胞，肾小管上皮细胞(HKCs)在ECM过量沉积中起了重要作用，其中包括促进胶原合成。曲尼司特(tranilast,Tran)作为抗过敏药在临床中应用较多而且有较长的历史，后来发现它具有抑制TGFβ1的生成，减少胶原的沉积，明显的抗纤维化作用[2]，其具体机制并不明确。结缔组织生长因子(CTGF)是TGFβ1下游重要的致纤维化因子，大剂量的重组人结缔组织生长因子(rhCTGF)可引起肾小管上皮细胞转分化(EMT)和ECM的产生[3]。Tran能否作用于CTGF,减轻EMT的形成和ECM的沉积来发挥抗纤维化的作用，国内外很少报道，本实验就此将进一步探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要实验材料和仪器

　　人肾小管上皮细胞株(HKCs，上海长征医院梅长林教授惠赠)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM/F12(1∶1)培养液(美国GIBCO公司)，MTT、DMSO(美国Sigma公司),曲尼司特(中国药科大学制药厂)，rhCTGF(美国Peprotech公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，两步法RTPCR试剂盒、Taq PCR Mix(美国Promega公司)，兔抗Ⅳ胶原蛋白多克隆抗体(美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶(HRP)、标记异硫氢酸荧光素(FITC)标记、4′,6二脒基2苯基吲哚荧光素(DAPI)标记的兔抗IgG抗体(武汉凌飞科技有限公司)，PCR仪(Biometra 96T,德国)，荧光显微镜(LEICA DM4000B,德国),共聚焦显微镜(0lympus IX81,日本)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养和分组:HKCs，加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/L，在37 ℃、20%CO2培养箱内培养，当传代细胞长至70%～80%融合时换无血清培养液静置24 h，以同步化处理后用于实验。分3组：⑴对照组;⑵rhCTGF(20 ng/mL)干预组;⑶rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组。

　　1.2.2 细胞毒性试验:取对数生长期的HKCs，用含有Tran(100 μmol/L)的DMEM/F12培养基配成5×104/mL的单细胞悬液，按每孔180 μL接种于96孔板中，同时设2孔空白对照组调零和阴性对照组(只加培养液)，每组设4个平行孔。接种完毕后将细胞放置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养24 h。小心吸除培养液，每孔加MTT (5 mg/mL) 20 μL，继续培养4 h，弃去孔内全部液体，加入DMSO 150 μL，振荡5 min;在酶标仪上测定波长490 nm处的吸光度值OD490，A490。

　　1.2.3 HKCs形态学观察:加入各组试剂后，每8 h在倒置显微镜下观察细胞形态变化，48 h后倒置显微镜下照相。

　　1.2.4 激光共聚焦免疫荧光镜检测HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达:以4%多聚甲醛固定细胞，用0.1%Tritonx100破膜，2%BSA封闭，室温下作用45 min，以含2%BSA的PBS溶液稀释一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，再次洗涤后加带有荧光素的二抗(1∶200)室温下孵育60 min观察，拍照。

　　1.2.5 RTPCR检测胶原Ⅳα1 mRNA的表达:干预48 h后，Trizol提取总RNA，按两步法RTPCR试剂盒检测胶原Ⅳα1 mRNA的表达，胶原Ⅳα1引物上游5′CCAGGAGTTCCAGGATTTCA3′，下游5′CACTGTGGGTCATCTTATTGTTTG3′，[452 bp];βactin为内参照，其上游引物序列为5′CTGTCCACCTTCCAGCAGA 3′，下游引物序列为5′CTCGCTCCAACCGACTGCT3′，[268 bp]。胶原Ⅳα1 cDNA扩增的条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 45 s，退火57 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s, 共32个循环，结束循环后再延伸72 ℃ 10 min，4 ℃终止。取5 μL PCR扩增产物于质量浓度为1 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，采用kodak science凝胶图像分析系统扫描、分析电泳条带，以胶原Ⅳα1与βactin的电泳条带的光密度比值来作为胶原Ⅳα1 mRNA的相对表达量。

　　1.2.6 West Blotting检测胶原Ⅳα1蛋白的表达:取各组细胞，弃上清，1×PBS洗3遍，加入细胞裂解液，收取蛋白质，4 ℃ 1 200 r/min离心30 min，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg的蛋白上样量，10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳60 V 30 min、120 V 60 min，室温下100 V转膜60 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗3次，加入一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，PBST洗3次，每次5 min，HRP标记的二抗室温孵育1.5 h，PBST洗3次，显色并曝光成像，扫描图像并用图像分析软件进行信号吸光度分析。

　　1.2.7 统计学处理:全部实验数据采用均数±标准差(x±s)表示，用t检验，差异的显著性采用单因素方差分析和q检验，用SPSS 11.0软件进行统计分析，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Tran的细胞毒性

　　HKCs与含Tran(100 μmol/L)的DMEM/F12培养基共培养24 h，测出的吸光值与吸光度组比值为(97±2.0)%，100 μmol/L的Tran对HKCs没有毒性。

　　2.2 Tran对rhCTGF刺激的HKCs形态的影响

　　倒置显微镜下观察，正常HKCs细胞为不规则椭圆形贴壁细胞,培养液中加入rhCTGF(20 ng/mL)48 h后，可见大部分细胞由椭圆形变为长梭形，rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组大部分细胞为椭圆形，少部分为梭形(图1：A～C)。

　　2.3 Tran对rhCTGF刺激的HKCs胶原Ⅳα1蛋白表达的影响

　　正常情况下，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达很少。20 ng/mL的rhCTGF刺激24 h，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达明显增强，与对照组比，有显著性差异(P<0.05)。曲尼司特(100 μmol/L)+rhCTGF(20 ng/mL)干预后，HKCs胶原Ⅳα1蛋白的表达明显减少，与rhCTGF(20ng/ml)干预组比，有显著性差异(P<0.05)，见图2。

　　2.4 Tran对rhCTGF刺激的HKCs胶原Ⅳα1 mRNA表达的影响

　　用rhCTGF(20 ng/mL)刺激HKC细胞48 h，结果表明HKCs的胶原Ⅳα1 mRNA水平与βactin的电泳条带的光密度比值为0.54±0.05，对照组为0.18±0.03，有显著性差异(P<0.05)。rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组HKC细胞表达胶原Ⅳα1 mRNA水平为0.28±0.04，与rhCTGF(20ng/mL)干预组比，有显著性差异(P<0.05),见图3。

　　图3 曲尼司特对rhCTGF刺激的HKCs

　　表达胶原Ⅳα1 mRNA的影响

　　1.对照组; 2.rhCTGF(20 ng/mL)干预组;

　　3.rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组; 4.Marker。

　　2.5 Tran对rhCTGF刺激的HKCs表达胶原Ⅳα1蛋白的影响

　　用rhCTGF(20 ng/mL)刺激HKCs 48 h，胶原Ⅳα1蛋白表达明显增加，与对照组比,有显著性差异(P<0.05)。曲尼司特(100 μmol/L)干预后，胶原Ⅳα1蛋白的明显下降，与rhCTGF(20 ng/mL)干预组比，有显著性差异(P<0.05)(见图4)。

　　图4 Tran对rhCTGF刺激的HKC细胞

　　表达胶原Ⅳα1蛋白的影响

　　1.对照组;2.rhCTGF(20 ng/mL)干预组;3.rhCTGF(20 ng/mL)+Tran(100 μmol/L)干预组。

　　3 讨论

　　Tran是1982年由日本Kissei公司首先研发上市的一种新型的过敏介质阻释剂，临床上用来作为抗过敏药,预防和治疗各种变态反应性疾病。后来发现有明显的抗纤维化的作用，广泛用来治疗皮肤瘢痕疙瘩、硬皮病、血管成形术后再狭窄等。尤其抗肾脏纤维化方面，Tran可以减轻单侧输尿管梗阻模型(UUO)[4]、5/6肾切除模型[5]、糖尿病大鼠模型[6]的肾脏纤维化，起到明显肾保护作用。临床上有作者观察Tran可以减少早期糖尿病肾病的蛋白尿和尿中的胶原Ⅳ的排泄[7]。

　　Tran抗纤维化的机制主要是抑制包括肾间质成纤维细胞在内的多种细胞的TGFβ1的释放。在肾组织中，TGFβ1引起肾小管上皮细胞EMT、ECM的沉积，导致肾脏纤维化。然而，Tran具体发挥效应机制并不清楚。有报道Tran可能是抑制了TGFβ1磷酸化的Ⅰ型、Ⅱ型受体或受体酪氨酸激酶、受体苏氨酸激酶而发挥抗纤维化作用[8]。

　　CTGF是TGFβ1下游的致纤维化因子，可引起肾小管上皮细胞EMT、肾间质ECM的沉积，导致肾脏纤维化，Qi等用外源性大剂量的rhCTGF可引起肾小管上皮EMT和细胞外ECM的产生[9]。本实验中20 ng/mL的rhCTGF作用于HKCs 48 h后，倒置显微镜示HKC细胞大部分由正常的椭圆形变为梭形，发生了EMT，且HKCs胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白表达增多，胶原Ⅳα1是ECM的典型代表，说明rhCTGF引起HKCs的ECM产生。加入Tran后，HKC细胞大部分为正常的椭圆形，小部分为梭形，细胞胶原Ⅳα1 mRNA和蛋白表达明显降低，说明曲尼司特能减少rhCTGF引起的ECM的沉积，这与Qi等[9]近期观察结果一致。至于Tran影响rhCTGF减少ECM的机制并不明确，或作用于某种黏附分子，或作用于细胞内CTGF的受体，国内外未见报道。

　　上述实验表明Tran抑制了TGFβ1、CTGF的产生，同时抑制肾小管上皮细胞EMT、减少ECM的沉积，而且对细胞的毒性小，用于临床抗过敏历史较久、副作用较少，可能被广泛用于临床治疗肾脏纤维化。

　　(文中图1～2见封三)

　　【参考文献】

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　　[7]Soma J,Sato K,Saito H,et al.Effect of tranilast in earlystage diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(10):2 795-2 799.

　　[8]Mifsud S,Kelly DJ,Qi W,et al.Intervention with tranilast attenuates renal pathology and albuminuria in advanced experimental diabetic nephropathy[J].Nephron Physiol,2003,95(4):p83-91.

　　[9]Qi W,Chen X,Twigg S,et al.Tranilast attenuates connective tissue growth factorinduced extracellular matrix accumulation in renal cells[J].Kidney Int,2006,69(6):989-995