阻断肾素.血管紧张素系统对糖尿病大鼠肾脏血管紧张素ⅡAT1受体的影响

　　作者：　张莉，马骥，顾勇，林善锬　(1.南京医科大学第一附属医院肾内科，江苏南京 210029;2.复旦大学附属华山医院肾内科，上海 200040)

　　Effect of peroxiredoxin1overexpression on oxidant injury of human PC3prostate cancer cells

　　SHEN Chuan-lu，ZHU Jun

　　(Department of Pathology and Pathophysiology，School of Basic Medical Science，Southeast University，Nanjing210009，China)

　　Abstract:Objective To investigate the effect of peroxiredoxin1(Prx1)overexpression on resistance of human tumor cells to hydrogen peroxide.Methods pcDNA.Prx1plasmid was constructed and stably transfected into human PC3prostate cancer cells.Western blot analysis was used to monitor expression of peroxiredoxin1in the stable transfectants.MTT assay was used to observe survival rate of the stable transfectants.Results Compared with pcDNA3vector，there was significant in-crease of peroxiredoxin1expression in the PC3cells stably transfected with pcDNA3.Prx1monitored by Western blot analysis.When treated with0.25，0.5，1and2mmol?L-1 of hydrogen peroxide，the PC3cells stably transfected with pcDNA3.Prx1increased suvival span.Conclusion Overexpression of Prx1obviously increases resistance of human PC3prostate cancer cells to hydrogen peroxide.

　　Key words:peroxiredoxin1;prostate cancer cell;hydrogen peroxide;stable transfection

　　[摘要]目的: 研究链脲佐菌素(STZ)诱导的早期糖尿病大鼠肾组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)AT1受体的表达以及阻断肾素.血管紧张素系统(RAS)对其的影响。 方法: 糖尿病模型大鼠随机分为伊贝沙坦组、福辛普利组、两药合用组及糖尿病对照组，另设一正常对照组。采用放射免疫法检测各组血浆AngⅡ水平，免疫组织化学法及Western blot方法半定量检测肾组织中AT1受体的分布和表达。 结果: 糖尿病大鼠肾组织AT1受体表达较正常大鼠明显减弱，各用药组AT1受体表达较正常对照组明显上调。 结论: 糖尿病时肾脏局部RAS存在活性改变和重新分布。

　　[关键词] 糖尿病肾病;肾素.血管紧张素系统;血管紧张素Ⅱ;受体;大鼠

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制尚未完全阐明。多方面研究揭示，肾素.血管紧张素系统(RAS)在DN的发病机制中起着非常重要的作用[1，2] 。一般认为，RAS可以分为循环RAS和局部RAS两个既有区别又密切联系的部分。在糖尿病状态下，循环RAS和肾脏局部RAS活性的高低及动态变化等可能是不同甚至是相反的。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为RAS的最主要组分，其生物活性主要通过其AT1受体发挥作用[3] 。肾脏AT1受体的表达可间接反映局部RAS的活性。对于糖尿病状态下肾脏局部RAS的调节状况目前尚存很多争议，各研究结果也时有分歧。本研究通过检测AT1受体在糖尿病大鼠肾脏各部位的表达，观察此时局部RAS的活性变化，并探讨通过用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)福辛普利和AngⅡ受体拮抗剂(ARB)伊贝沙坦，阻断RAS后对AT1受体表达的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及分组

　　200～240g雄性SD大鼠，购自并饲养于复旦大学医学院实验动物中心(清洁级环境)。环境温度维持在(20±2)℃。大鼠进食标准饮食，自由饮水。所有大鼠随机分为5组，每组6只:糖尿病对照组(diabetic control group，DC组)，伊贝沙坦组(irbesartan group，Ⅰ组)，福辛普利组(fosinopril group，F组)，伊贝沙坦与福辛普利合用组(irbesartan plus fosinopril group，IF组)，正常对照组(normal control group，NC组)。

　　1.2 糖尿病动物模型制作

　　除正常对照组大鼠外，其余大鼠按55mg?kg-1 体重一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，48h后尾静脉采血，用快速血糖仪[one TouchⅡ型，强生(中国)有限公司]测定全血血糖，血糖>16.7mmol?L-1 同时用尿糖试纸测定尿糖+++～++++者确定为糖尿病大鼠。成模后稳定4～5d开始用药干预，伊贝沙坦和福辛普利溶解于磷酸盐缓冲液中制成7mg?ml-1 的溶液(pH7.4)，每日1次灌胃给药，剂量:伊贝沙坦组和福辛普利组均为40mg?kg-1 ?d-1 ;合用 组为两药各20mg?kg-1 ?d-1 ;对照组仅给予等量磷酸盐缓冲液灌服。观察时间为4周。整个实验期间不使用胰岛素。

　　1.3 标本制备

　　实验第4周末，大鼠空腹16h后在3%水合氯醛1ml?(100g)-1 腹腔注射麻醉下行腹主动脉插管，收集2ml全血，注入预冷的含20μl EDTA的离心管，4℃离心(1500r?min-1 )5min分离血浆。取1ml血浆，放入另一管已预冷的含有10μl酶抑制剂1和20μl酶抑制剂2(试剂盒中提供)的试管中摇匀，置于-20℃冰箱保存，待测AngⅡ。其余血标本待作生化检测。取血毕，经腹主动脉注入4℃预冷的生理盐水反复灌洗至肾脏转为苍白，分离肾脏，截取厚度2mm左右的一片肾组织置于4%的中性甲醛缓冲液中固定。其余肾组织于液氮中暂存。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 血糖测定

　　由日立7170型全自动生化分析仪测得。

　　1.4.2 血浆AngⅡ水平测定 采用放射免疫法(试剂盒购自中国原子能科学研究院)测定。

　　1.4.3 免疫组织化学法检测肾脏AT1受体表达

　　肾组织标本固定48h，石蜡包埋，切成4μm厚切片，常规脱蜡至水，1.5%H2 O2 .甲醇处理，加一抗1∶100兔抗大鼠AT1抗体(Santa Cruz公司)，4℃过夜，加二抗.HRP复合物(Antibody Diagnostica Inc.)于37℃孵育30min，DAB(Antibody Diagnostica Inc.)显色4min，苏木素复染。阳性组织呈棕黄色，而阴性部分呈蓝色。

　　1.4.4 Western blot法检测肾脏AT1受体蛋白表达

　　肾组织加入细胞裂解液匀浆，采用改良Lowry法测定蛋白浓度。取蛋白100μg经8%的SDS.PAGE凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，7%的脱脂奶粉.PBST溶液室温下封闭1h，洗膜后加入7%的脱脂奶粉.PBST溶液配制的兔抗AT1抗体(Santa Cruz公司)4℃过夜，再用HRP标记的二抗进行杂交，最后加入免疫印记化学发光试剂进行显影。杂交结果于BIO.RAD2000型凝胶成像系统在白光下扫描后用QUANTITY ONE软件进行吸光度分析，强度以吸光度与面积的乘积(A×mm2 )来表示。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据以ˉx±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较用方差分析或非参数检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组血糖、AngⅡ水平的变化

　　SD大鼠腹腔单剂量注射STZ后观察4周，模型组动物血糖水平明显升高，说明已经成功建立糖尿病动物模型。各用药组血糖水平与DC组相比无显著性差异，提示在本研究观察期间，各药物干预对糖尿病大鼠的糖代谢无显著影响。DC组血浆AngⅡ水平较NC组下降但尚未达到统计学差异(P>0.05)，Ⅰ组AngⅡ水平较DC组和NC组分别增高达3.7倍和2.4倍。F组和IF组较DC组无明显变化。提示各药物干预对循环AngⅡ的影响是不同的(表1)。表1 各组大鼠血糖、AngⅡ水平变化比较(略)

　　2.2 各组大鼠肾组织AT1受体免疫组织化学结果

　　如图1所示，在正常大鼠肾脏，AngⅡ的AT1受体主要表达在近端小管、入出球小动脉、系膜区、致密斑等部位。糖尿病大鼠除近端小管仍有明显表达外，其它部位的染色明显减弱。各用药组的AT1受体表达明显上调，特别在系膜区、毛细血管脏层上皮细胞、远端小管等部位免疫染色较糖尿病对照组及正常组均显著增强。

　　3.3 各组大鼠肾组织AT1受体Western blot结果

　　肾皮质蛋白经10%的SDS.PAGE胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，用AT1受体的一抗进行Western杂交后发现在50000位置出现阳性条带。光密度扫描后发现，DC组肾皮质AT1受体表达量明显减少，仅为正常对照的56.96%;各用药组的AT1受体表达量均显著增加，分别达到正常对照的145.69%(Ⅰ组)、151.38%(F组)和140.00%(IF组)，较DC组增加2倍以上，各用药组间无明显差别(图2)。

　　3 讨 论

　　目前，在糖尿病状态下RAS的调节状况尚无定论，然而大量研究结果表明:ACEIs和ARBs能明显降低蛋白尿，延缓DN的进展[4，5] ，提示RAS异常在糖尿病发生发展过程中具有重要地位。一般认为RAS可以区分为循环RAS和局部RAS两个既有区别又密切联系的部分。就循环RAS而言，各个研究结果很不一致。Hsueh等[6] 发现糖尿病早期血浆肾素活性(PRA)和AngⅡ水平是正常或降低的。然而，循环RAS可能随糖尿病病程的不同时期而有所变化。Kikkawa等[7] 报道，PRA和AngⅡ在STZ注射后1～2周的糖尿病大鼠中明显升高，而在4～8周时明显降低。本研究表明，STZ诱导的糖尿病大鼠模型在4周末血浆AngⅡ水平略低于正常对照组，与Kikkawa等[7] 的结果一致。但必须指出的是，循环RAS的变化并不与肾脏局部RAS的改变相一致。换言之，肾脏局部RAS的调节可能是相对独立的，并不依赖于血浆RAS的变化。功能性、免疫组织化学及mRNA研究均支持一个完整的肾内RAS的存在，并且AngⅡ在肾小球滤液、近端小管 液、出球小动脉血浆及间质液的浓度均超出循环血浆中的水平。糖尿病状态下(尽管此时并没有系统RAS的激活)应用ACEI所引起的剧烈的肾内反应同样提示肾内RAS是活跃的。Anderson等[5] 发现，在糖尿病大鼠肾脏存在着ACE活性改变和重新分布，尽管全肾的ACE活性略有下降，但肾小球及肾内血管系统的ACE活性是增加的，同时小管.间质的ACE活性是下降的。另外，Cheng等[8] 发现，AngⅡ刺激对糖尿病肾脏不同组分AT1受体的影响是不同的，即AngⅡ刺激能够下调肾小球的AT1受体表达(负反馈抑制)，但上调近端小管的AT1受体(正反馈)。本研究对AT1受体的免疫组织化学和Western blot分析证实，糖尿病大鼠的AT1受体在肾小球、小动脉、小管的表达均明显下调，反过来也支持上述观点，即糖尿病状态下肾脏局部存在着RAS活性的变化和重新分布，特别是肾小球和肾内血管的RAS处于活跃状态，与Cheng等[8] 的结论一致。因此，尽管目前对糖尿病状态下肾内RAS的变化还有一定争议，但多数观点认为，其总的趋势是活跃的，引起的AngⅡ增加参与了DN的发生和发展。

　　目前临床上能够获得的、可阻断RAS的药物有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEIs)和AT1受体拮抗剂(ARBs)两类。由于对RAS阻断机制的不同，使得这两类药物之间既有联系又有区别。其差异主要表现在下列几个方面:(1)ACEIs使AngⅠ转化为AngⅡ减少，削弱了AngⅡ对肾素的负反馈抑制，从而引起肾素水平的代偿性升高。而应用ARBs时，由于AngⅡ对球旁器上AT1受体的刺激被阻断，正常的负反馈抑制也被阻断，从而引起肾素和AngⅡ水平均升高[9] 。本研究结果表明，应用ARBs后循环AngⅡ明显升高，体现了这种反馈调节。(2)ACEIs只能减少ACE依赖性的AngⅡ产生，而ARBs可以从受体水平阻断任何来源的AngⅡ的效应。由于在很多器官中存在着非ACE途径的AngⅡ产生，因而理论上ARBs对RAS的阻断可能更为完全。本研究AT1受体免疫组织化学和Western blot结果显示，各用药组大鼠肾组织AT1受体的表达较DC和NC组明显上调，但各用药组间并无显著性差异。一方面提示ACEIs和ARBs对肾脏局部RAS的阻断减少了AngⅡ对其AT1受体的刺激，从而引起AT1受体的代偿性表达上调;另一方面也提示各用药组对RAS阻断的效果是相似的，并没有观察到ARBs较ACEIs对RAS有更强的阻断效果。一个可能的解释是:与心肌等组织不同的是，肾脏内AngⅡ的生成以血管紧张素转换酶途径(ACE途径)为主，旁路的非ACE途径则较为次要[10] ，因而ACEIs对肾脏RAS的阻断可能已接近完全。

　　总之，本研究证实，在早期糖尿病肾组织中存在AngⅡAT1受体分布和表达的异常，提示糖尿病时肾脏局部RAS存在活性改变和重新分布。应用ARBs和ACEIs后均引起其AT1受体的幅度相似的代偿性上调，提示两者对肾脏局部RAS的阻断程度也是相似的。

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