冬虫夏草对5/6肾切除大鼠肾脏皮质细胞外基质积聚的影响

　　作者：马瑞霞 刘丽秋 周丽敏 作者单位：青岛大学医学院附属医院肾内科，山东 青岛 266002

　　【摘要】 目的 观察冬虫夏草对5/6肾切除大鼠肾脏皮质细胞外基质(ECM)积聚的影响，探讨其对肾脏保护机制。方法 将正常Wistar大鼠(50天龄)36只随机分为正常对照组、5/6肾切除组和虫草制剂组。5/6肾切除组、虫草制剂组分别行5/6肾切除制备进行性肾小球硬化模型。虫草制剂组每天给予虫草制剂(百令胶囊4 g·kg-1·d-1)水提取液灌胃，进行干预治疗。第2次术后4、9 w分别测定大鼠血生化指标;观察肾脏病理变化，用免疫组织化学检测肾组织胶原Ⅳ、纤维连接蛋白(FN)。结果 冬虫夏草能降低肾小球硬化指数(GSI),减少胶原Ⅳ、FN表达;减少尿蛋白排泄，增加肾组织MMP-2mRNA表达，减少TIMP-2mRNA的表达。结论 冬虫夏草可能通过增加5/6肾切除大鼠肾脏MMP-2的活性和降低TIMP-2的表达，从而能增加ECM降解和减轻肾小球ECM积聚。

　　【关键词】 肾大部切除;冬虫夏草;基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶组织抑制因子

　　肾小球硬化是肾衰竭末期病理改变之一,以肾小球球内系膜细胞、系膜基质沉积,系膜区增宽,伴炎性细胞浸润为主要改变。正常的系膜基质成分主要包括Ⅳ型胶原、层黏蛋白、纤维连接蛋白(FN)和硫酸肝素糖蛋白、硫酸软骨素糖蛋白等。细胞外基质(ECM)积聚是导致肾小球硬化的病理基础，其合成与降解之间的平衡是决定ECM积聚的重要环节。基质金属蛋白酶(MMP-2)是ECM重要的降解酶，在ECM降解中起重要作用，其活性受金属蛋白酶组织抑制物(TIMP-2)的调节〔1〕。冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌的子座及其寄主蝙蝠科昆虫蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合物，我国名贵中药材,具有补肺益肾、扶正益损等功效。虫草有良好的抗纤维化作用,能抑制成纤维细胞的增殖生长及合成ECM的能力〔2〕。本研究旨在观察冬虫夏草对5/6肾切除大鼠肾皮质MMP-2及TIMP-2的活性和表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠36只(购自青岛市药检所)随机分为正常对照组、模型组、虫草制剂组，每组12只，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，分别将左侧肾脏上、下极各切除约1/3大小的肾脏。3 d后行右侧肾脏切除术。两次手术共切除肾脏总体积约5/6。正常对照组也行两次手术，但不切除肾脏，开腹游离肾脏后即关腹。末次术后第3天开始进行干预治疗：虫草制剂组每天给予百令胶囊(4 g·kg-1·d-1)水提取液灌胃;5/6肾切除组和正常对照组每天给予等量的自来水灌胃，大鼠自由饮水、进食。第2次术后4、9 w每组分别处死6只大鼠。

　　1.2 标本采集 处死大鼠前1 d将大鼠置金属代谢笼，留取24 h尿液。自腹主动脉取血后处死，取部分肾组织(兼顾皮、髓质)置10%福尔马林固定液固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3 μm厚连续切片，用于HE染色、PAS染色和免疫组化。剩余的大部分组织置于液氮中，后转入-70℃冰箱保存备用。

　　1.3 血、尿生化检测 采用全自动生化分析仪测定尿蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)等指标。

　　1.4 肾小球硬化指数(GSI) 经PAS染色，光镜下根据肾小球毛细血管袢塌陷或消失、肾小囊断裂或纤维素样物渗出、系膜细胞增殖和系膜基质增宽，半定量评价肾小球硬化程度 〔3〕。将肾小球硬化程度分为4个等级：(0)：基本正常或肾小球硬化面积<25%;(+)：25%～50%;()：50%～75%;()：>75%。据每片肾小球平均硬化面积积分计算出GSI表示肾小球硬化程度，GSI=〔(1×n1+2×n2+3×n3)/每片肾小球总数〕×100%(n表示病变小球数)。

　　1.5 免疫组化 采用SABC法检测肾组织中FN、胶原Ⅳ。胶原Ⅳ单克隆抗体为DATA公司产品，FN单克隆抗体为Santa Cruz公司产品。具体步骤为：3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，FN用复合酶消化，胶原Ⅳ用EDTA (pH =8.0)微波修复;加一抗(FN 1∶50，胶原Ⅳ 1∶100)，4℃过夜;加生物素化二抗;加三抗;DAB显色。结果以细胞膜和ECM中出现明显的棕色反应为阳性，用Tanaka〔4〕的标准判断评分，根据阳性面积占肾小球和肾小管区域的面积之比评为0～4分，即0分为阴性，1分为阳性面积<25%，2分<50%，3分<75%，4分>75%，每张切片在40倍目镜下连续取30个视野，进行综合评分。

　　1.6 RT-PCR 肾脏RNA的提取采用Trizol(Gibco公司)试剂一步抽提法，再逆转录成cDNA(Promega逆转录试剂盒)。以适量cDNA为模板，再Taq DNA聚合酶催化下行PCR，参照文献设计PCR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GAPDH的引物为：正链：5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′;负链为：5′-GGATGCAGGGATGATGTTC-3′。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min共35个循环，72℃延伸10 min，终产物为206 bp。MMP-2的引物为：正链：5′-GATCATTGGTTACACACCTGACC-3′;负链为：5′-TGCTCCCATCGACCAAAGT-3′。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min共35个循环，72℃延伸10 min，终产物为152 bp。TIMP-2的引物为：正链：5′-ATCAGAGCCAAAGCAGGTGAGCG-3′;负链为：5′-GGTAATGTGCATCTTGCCATCTCC-3′。扩增条件：94℃预变性4 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min共35个循环，72℃延伸5 min，终产物为243 bp。PCR产物于含溴化乙锭(0.5 μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪观察结果并拍照。用激光密度扫描仪扫描照片，计算曲线下峰面积作为PCR产物的相对含量。

　　1.7 统计学处理 所有数据用x±s表示，组间比较应用SPSS11.0进行F检验。

　　2 结果

　　2.1 冬虫夏草对大鼠24 h尿蛋白定量及肾功能的影响 5/6肾切除术后4 w大鼠尿蛋白排泄增高，术后9 w增高更明显，Cr和BUN也升高。虫草制剂组较正常对照组尿蛋白排泄也是增高的,但较5/6肾切除术组尿蛋白排泄明显减少，Cr和BUN有所下降(表1)。

　　2.2 冬虫夏草对肾脏病理变化的影响

　　2.2.1 光镜检查 在HE和PAS染色中，5/6肾切除组大鼠可见明显的肾小球增生、肥大，局灶节段性肾小球硬化，间质有大量淋巴细胞浸润，部分小管内可见蛋白管型。而虫草制剂组与之相比病变明显减轻，与术后4 w时比较，术后9 w的GSI(见表2)。

　　2.2.2 免疫组化 正常对照组大鼠肾脏胶原Ⅳ、FN表达较弱，而5/6肾切除后二者表达均增强，术后9 w较4 w表达更强，与正常对照组差异显著(P<0.01)。虫草制剂组，虽然二者表达均有增强，但较5/6肾切除组轻(P<0.05)(表2)。

　　2.2.3 冬虫夏草对MMP-2、TIMP-2mRNA表达的影响 正常情况下MMP-2和TIMP-2mRNA在肾组织均有表达，5/6肾切除术后4 w MMP-2表达降低，而TIMP-2mRNA表达增高，9 w后两者变化更明显。虫草制剂组在术后4 w TIMP-2mRNA表达减少，术后9 w TIMP-2mRNA表达进一步减少，较5/6肾切除组差异显著(P<0.01)，而MMP-2mRNA表达虽比对照组低(P<0.05)，但较5/6肾切除术组明显升高(均P<0.05)(表3)。

　　表1 各组24 h尿蛋白定量及肾功的比较(略)

　　与正常对照组相比：1)P<0.05，2)P<0.01;与5/6肾切除组相比：3)P<0.05，下表同

　　表2 各组胶原Ⅳ、FN和GSI的比较(略)

　　表3 各组MMP-2、TIMP-2mRNA表达的比较(平均光密度，n=12)(略)

　　与正常对照组相比：1)P<0.05，2)P<0.01，与5/6肾切除组相比：3)P<0.05，4)P<0.01

　　3 讨论

　　5/6肾切除模型通过减少有效肾单位,致肾小球通透性改变,与人慢性肾衰竭相似，是较为经典的慢性肾衰竭模型〔5〕。Song 等〔6〕观察到5/6肾切除术后13 w,大鼠出现明显的血清BUN、Cr升高、高脂血症、蛋白尿等肾衰竭的表现及肾脏组织形态学的改变,并发现肾组织中MMP-2活性降低。本研究中，大鼠在5/6 肾切除术后4 w开始，24 h 尿蛋白排泄明显增加，肾功能恶化,血Cr及BUN升高。可见肾小球增生、肥大,呈现局灶节段性硬化,PAS 染色进一步显示肾小球基底膜增厚,ECM增多;残肾病理改变为肾小球代偿性肥大、程度不等的硬化，肾小管萎缩和间质炎性细胞浸润，证明慢性肾衰竭模型建立成功。经冬虫夏草治疗后蛋白尿排泄率明显降低，Cr及BUN降低，表明冬虫夏草具有较好的肾脏保护作用。肾小球硬化的动物模型研究发现，正常情况下表达的基质成分(Ⅳ型胶原、FN、层黏蛋白、硫酸肝素糖蛋白)过度表达，其中Ⅳ型胶原的合成和降解异常尤为明显和重要〔7〕。在局灶节段性肾小球硬化(FSGS)中可见大量的Ⅳ型胶原和FN的堆积在系膜区，系膜区进行性扩张，最后导致肾小球毛细血管袢闭塞、皱缩。本研究结果显示，模型组大鼠术后4 w，肾小球内Ⅳ型胶原和FN表达，术后9 w更明显;免疫组化染色也表明肾小球ECM成分发生过量聚积。冬虫夏草可显著降低Ⅳ型胶原和FN的表达量，从而减少ECM积聚，GSI明显降低，缓解肾小球硬化的进展。这可能是其肾保护作用机制之一。

　　MMPs是一组结构与功能同源的锌离子依赖性蛋白酶超基因家族,几乎可降解所有ECM。MMPs表达下调和酶活性过度受抑,则参与了许多表现为ECM堆积的病理过程。MMP-2作为MMPs的主要成员。导致肾损害多种因素可通过MMPs基因启动子区域TGF-β控制元件(TIE)，或通过激活蛋白(AP)直接或间接地影响MMPs基因的表达，直接影响系膜细胞ECM的表达，促进肾小球硬化的发生和发展〔8〕。TIMPs是MMPs的天然的特异性抑制因子，能在多种细胞因子诱导下产生,能抑制绝大多数的MMPs，TIMP-2作为TIMPs的主要成员，通过抑制MMPs的活性而抑制ECM的降解。MMP-2的表达下调或活性下降以及其特异性抑制因子TIMP-2表达上调,可导致对Ⅳ型胶原和FN的降解减少,ECM积聚，在肾小球硬化的发生和发展过程中,可能发挥重要作用〔9〕。

　　本实验显示,5/6肾切除大鼠肾组织中MMP-2的表达明显下调,而TIMP-2的表达明显上调,在病理状态下形成新的平衡,这种新的平衡状态导致MMP-2对ECM的降解减少,促使ECM在DM大鼠肾小球内的积聚,从而导致肾小球硬化。而经冬虫夏草治疗9 w后 MMP-2表达恢复性上调，TIMP-2的表达明显下调。由此可见,冬虫夏草可通过下调TIMP-2的表达及上调MMP-2的表达,促进肾小球ECM的降解,Ⅳ型胶原和FN的表达量降低，从而达到延缓肾小球硬化的作用。

　　总之，冬虫夏草增加肾脏MMP-2的表达，减少TIMP的表达，加强ECM，如Ⅳ型胶原、FN的降解，可能是其减少大鼠尿蛋白排泄，保护肾功能的机制之一。但冬虫夏草如何启动这一系列的信号转导有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Schnaper HW.Balance between matrix synthesis and degradation：a determinant of glomerulosclerosis〔J〕.Pediatr Nephrol，1995;9(1):104-11.

　　2 陈晓东.百令胶囊治疗慢性肾衰的动物实验研究〔J〕.实用中医内科杂志，2004;18(6)：307-10.

　　3 Raij L，Azar S，Keane W.Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats〔J〕.Kidney Int，1984;26(2):137-43.

　　4 Tanaka R，Sugihara K.Internephron heterogeneity of growth factors and sclerosis-modulation of platelet-derived growth factor by angiotensin〔J〕. Kidney Int,1995;47(1):131-9.

　　5 Romero F，Radriguez IB，Para G,et al.Myocophenolate mofetil prevents the progressive renal failure induced by 5/6 renal abalation in rats〔J〕.Kidney Int，1999;55 (3)：945-55.

　　6 Song Y，Li C，Cai L.Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor-mediated extracellular matrix accumulation〔J〕.Exp Mol Pathol，2004;76 (1)：66-75.

　　7 高俊瑞,马健飞,张 全.Ⅳ型胶原与肾小球疾病〔J〕.临床荟萃,2001;16 (12):569-71.

　　8 Benigni A，Remuzzi G.How renal cytokines and growth factor contribute to renal disease progression〔J〕.Am J Kidney Dis，2001;37(supple2):s21-4.

　　9 Woessner JF Jr.MMPs and TIMPs：a historical perspective〔J〕.Method Mol Biol,2001;151(1):1-23.