瑞舒伐他汀对高糖导致的血管形成障碍的影响

糖尿病导致的血管病变越来越引起人们的重视既往研究‘」发现糖尿病不仅可以导致增殖性血管病变(如视网膜病变、‘f!脏病变)，而且亦阻碍了心肌梗死后冠状动脉侧枝的形成，进而增加心肌梗死后发生心力衰竭的风险。同时，体外研究2发现高糖培养基明显抑制了内皮细胞的迁移、增殖及血管形成能力，进一步研究发现这可能与高糖导致的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)依赖的磷脂酞肌醇3一激酶(phos- phatidvlinositol 3-kinase，PI3 IA)/蛋自激酶B(protein kinase B , PIAB;又名Akt )/内皮一氧化氮合酶( endo- thelial nitric oxide svnthase , eNOS)通路的抑制有关。有拟卜究3发现他汀类药物可促进心肌梗死后心肌微血管的形成，改善心功能，但它对高糖导致的内皮细胞血管形成障碍的作用及机制尚不明确。因此，本研究旨在探讨瑞舒伐他汀对高糖导致的微血管内皮细胞血管形成障碍的影响及可能机制。

1材料与方法

1.1主要试剂 瑞舒伐他汀(1A2erck.美国);胎牛血清、改良Eagle 培养基( Dulbecco's modification of卜agle's medium , DMEM ) ( Gibco ,澳大AA1亚);胰酶(Amarisco美国); lilah-igel (BD，美国);兔抗鼠Akt ,磷酸化akt ( Ser'马 ) (p-Akt)、eNOS、磷酸化eNOS(Ser' `o)(p-elV 0引及阶actin抗体(Cell Signaling Technology,美国);ATTT试剂盒(Sigma，美国);Transwell小室(Sigma，美国); BCA蛋白试剂盒(碧云天公司生物技术公司);PI3 I< 抑制剂LY294002 ( Sigma，美国)。

1.2原代细胞的培养及细胞处理 4周龄雄性SD大鼠由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供，生产许可证号为SCXK(沪)2008 - 0016;实验在上海交通大学附属第六人民医院进行，使用许可证号为SYXIA沪)2006一0010。取大鼠心脏用灭菌的PBS去除血.渍，用剪刀去除心房组织，沿左心室剪开心脏，用镊子剥离心内外膜将心肌组织剪成糊状，滴加适量胎牛血清后均匀铺皿， 40 min后加人DAMEA'I培养基(含20%胎牛血清、 100 IU/m「青霉素、100 mg/mL链霉素、0. 1 mg/mL 肝素)72 h后去除组织块换液，待细胞铺满80%皿进行传代，取1代细胞进行实验分组:低糖组(5. 6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(33 .3 m mol/ 1葡萄糖)、瑞舒伐他汀组(33. 3 mmol/L葡萄糖+1.kmol/L瑞舒伐他汀)和LY294002组(33.3 mmol/L葡萄糖+ 1 A,mol/L瑞舒伐他汀+10 N mol/L LY294002 ) 0 24 h后，分别进行IVIatrigel , MTT以及Transwell实验，观察细胞的管腔形成、增梢及迁移能力;采用Western blotting技术检测Akt,p-Akt,eNOS和p-eNOS蛋白的表达。

1. 3 Mat吨e1实验观察微血管内皮细胞管腔的形成 取96孔板，实验孔加基质胶50 OL,置于37℃ 温箱孵育40 min后取出，每孔接种各组细胞2 x 10' 个，使培养液总体积为200 A,L，于温箱中继续培养 12 h，光学显微镜(4 x 10倍)下观察实验重复3次，通过软件计算分析管腔的形成长度或节点数目。

1.4 Transwell实验检测微血管内皮细胞的迁移能力 将1.5x10个微血管内皮细胞加人上层小室，并按分组情况给于不同处理;下层小室加入正常葡萄糖浓度的无血清D 1\'I E lAAT培养基24 h后去除培养液，4%甲醛固定小室底部细胞，结晶紫染色后显微镜观察实验重复3次.通过软件计算每个视野 (x 100倍)下细胞数目 1. 5 1A1'I"l'法检测微血管内皮细胞的增殖能力 微血管内皮细胞由0. 25 7c胰酶消化后在显微镜下计数，将2 000个/200闪」细胞接种于96孔板，放回培养箱常规培养。24 1:后按分组情况给予不同处理，分别于处理后0,6,12和24 h后加用ItIT"T法通过酶标仪侧定吸光度值实验重复3次，用吸光度值表示细胞的增殖能力 1.6 Western blotting法检测4kt, p-Akt, eNOS和 p-a A0S蛋白的表达 将分组后的微血管内皮细胞处理24 h后，将培养皿置于冰上，去除培养液，顶冷的PBS冲洗培养皿 2次。吸净PBS后，每皿加人RIPA裂解液(100 O,L )，将细胞刮至培养皿一侧移人离心管，于冰上裂解10 min ; 然后，4℃下12 000一15 000 r/min离心5 min;取适量上清液，采用BCA蛋自试剂盒测定蛋白浓度，余液移人另一个离心管与1/4体积的5 x SDS上样缓冲液混合后置于100℃水浴箱中加热10 min。各组上样量为30 A,g，恒压60 A电泳，30 min后恒压110 V , 电泳至嗅酚蓝到分离胶2/3时停止电泳。转膜时采用PDV A.膜，顺序按负极、3层滤纸、电泳胶一 Pt'DF膜A3层滤纸一正极，恒流250 mA , 4℃2h 转膜结束用1 x TBST洗5 min,5AAo脱脂奶粉室温封闭1. 5 h 1 x TBST稀释一抗I, 1kt 1 : 1 000 ; Akt

(Ser4")1:500;eNOs I:1 000;e1\ Os(se、，minSer)1:500」， 4 0C过夜，1 x TBST洗膜3次，10 min/次。1 x TBST 稀释二抗(1:1 500)，室温孵育1. 5 h，用1 x TBS'T 洗膜3次，10 min/次。在暗室配好化学发光(lectro- chemiluminescence , ECL )液滴加在PA Dp膜上，反应 2 min后在两层薄膜之间置人X线压片盒，卜附k 线压片2 min，最后于自动洗片机中显影、定影X 线片通过凝胶成像系统分析，计算各条带灰度值，以靶蛋白与内参蛋白的灰度值比值代表相应蛋白的表达 1.7统计学分析 采用SI'SS 17.。统计分析软件计量资料以、士、表示，多组间比较采单因素方差分析，两组间比较采用，检验P < 0. 05表明差异具有统计学意义

2结果

2. 1微血管内皮细胞的管腔形成情况 liIatrigel实验结果显示:在低糖培养基条件下微血管内皮细胞的管腔形成比较明显;高糖则明显减少了微血管内皮细胞的管腔形成;瑞舒伐他汀可明显改善高糖对微血管内皮细胞管腔形成的抑制;添加LY294002后，瑞舒伐他汀对高糖条件下血管形成的作用明显减弱(图1)。统计学分析显示:与低糖组相比，高糖组管腔形成明显减少(P <0.05);而瑞舒伐他汀组管腔形成较高糖组明显增加(P<0.05);与瑞舒伐他汀组相比，LY294002组管腔形成明显降低 (P<0.05);但瑞舒伐他汀并不能完全改善高糖导致的管腔形成减少，与低糖组相比较差异仍有统计学意义(P < 0.05(表1)

2. 2微血管内皮细胞的迁移能力 Transwell实验结果显示:与低糖组相比，高糖组内皮细胞的迁移能力明显降低;而瑞舒伐他汀显著改善高糖培养下内皮细胞的迁移能力，但这一作用被LY294002抑制(图2)。统计学分析结果显示:与低糖组相比，高糖组细胞迁移数目显著降低(p< 0.01);而瑞舒伐他汀组内皮细胞迁移数目明显多于高糖组(P < 0. 05;但瑞舒伐他汀并不能使细胞的迁移能力恢复到低糖组水平，两组间比较差异仍有统计学意义(P < 0. 05 );与瑞舒伐他汀组相比，LY294002组细胞内皮迁移数日明显降低，差异也有统计学意义(P<0.05)(表2)

2. 3微血管内皮细胞的增殖情况 IATT实验结果显示:低糖组的微血管内皮细胞明显增殖高糖则明显抑制微血管内皮细胞的增殖; 瑞舒伐他汀可明显改善高糖诱导的微血管内皮细胞增殖率降低，但LY294002明显阻止厂瑞舒伐他汀的作用统计学分析结果显示:各组细胞培养12和 24 h后，与低糖组相比，高糖组和I,Y294002组的细胞增殖能力明显降低(P <0.05);而与高糖组相比，瑞舒伐他汀能明显提高细胞的增殖能力，差异均具有统计学意义(P<0.05);但瑞舒伐他汀并小能使微血管内皮细胞增殖能力恢复到低糖组水平，差异仍有统计学意义(P < 0. 05)(表3)

2.4 Akt,I>-Akt,e`C)j和p-eAOS蛋白的表达 AC eAterAA hlottinA检测结果显示:与低糖组相比，高糖组，>-Aht ,1〕一。SOS蛋白的相对表达量均明显降低 (P < 0. 05 );与高糖组及LA-294002组相比，瑞舒伐他汀组p- AlAt , I->-e1AOS蛋白的相对表达量均明显升高 (P<0.05)但瑞舒伐他汀组与低糖组比较，p-,A kt , Ia-eNOS蛋白的相对表达量比较差异均尤统计学意义 (P >0.05)各组间Akt,eNOS蛋白的相对表达量比较.差异均尤统计学意义(P>0.05)(图3，表4)

3讨论

冠心病作为糖尿病的主要开发症，已经成为患者死亡的主要病因之一糖尿病不仅增加患者的急性心肌梗死发生率，而目_与血糖正常者相比糖尿病患者更易发生心肌梗死后心力衰竭’这可能与糖尿病导致的心肌缺血后冠状动脉侧枝形成减少相关牛但对其机制并不l一分明确本研究结果'U.示: 在高糖坑养基条件，微血管内皮细胞管腔形成欲目明显减少，同时发现细胞的迁移及增殖能力明显下降，这与以往研究结果一致但在瑞舒伐他汀组，我们发现他手J.可阻止高糖刘微血管内皮细胞十理功能的影响，但作用机制尚不明确.

高血糖作为一个独立危险因索以往研究证实高糖不仅可抑制内皮细胞的增殖和血管生成，同时还发现高糖导致PI3Ik/ akt/e\0通路活性降低f_ 此外Naruse等在主动脉内皮细胞的研究「A‘发现高糖不仅抑制胰岛素诱导的PI3h/_Akt% eYOh通路激活，同时抑制血管内皮生长因子依赖的PI3IA/Akt/ eA0A促血管形成通路激活临床研究9亦证实，与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的冠状动脉侧枝形成明显减少，.Akt/('NOc9通路明显下调本研究结果显示:微血管内皮细胞在高糖条件下培养24 E、后， AesteYn blotting检测结果显示内皮细胞p- Akt , p-eN! 05 蛋白的相对表达量明显降低，这与以往的研究，结果一致虽然我们并没有在正常糖浓度培养基中添加LY294002以进一步验证PI3Ik/Akt/e1tOS通路对血管形成、细胞增殖及迁移的作用，但已有研究‘。证实PI3IA/Akt/eN OS通路在上述细胞生理活动中扮演着重要角色因此我们推断本实验中高糖导致的微血管内皮细胞血管形成减少可能是通过抑制 PI3 K/A1At/eNOS激活来实现的。

近年的研究发现他汀类药物临床益处与其多效性密不可分。促血管形成作为他汀类药物的多效性之一，叮能为缺血性疾病提供新的治疗途径。在本实验中，我们发现瑞舒伐他f)‘处理后能明显改善高糖培养条件下微血管内皮细胞的血管形成、迁移和增殖等能力。同时wesletw blotting检测结果显iJS 与高糖组相比，瑞舒伐他汀能明显升一高，>-.Akt和 h一。SOS蛋自的相对表达量;但添加Ll'294002会阻山瑞舒伐他汀对内皮细胞功能的改善因此，以上研究结果说明瑞舒伐他汀可能通过直接激活Akt/eA 05 通路促进内皮_A pA,的血管形成，这与以往研究”报道的一伐他汀直接激活Al_At/e\'0通路进而促进缺而肢体川A管形成机制相符不过既往一也有研究‘2报道辛伐他刊可以通过增加A'I;GF的表达来改善糖尿病导致的llA1管形成障碍;向Isiknch，等’只研究发现普伐他门促进了缺血肢体的血管形成，但并没有增加A-h: GI的表达同时还有研究发现糖尿病导致的内皮功能紊乱与PI3IS/Akt!eAOS抑制相关’4，而他汀类药物则明显改善了高糖导致的内皮功能紊乱A5进一步研究发现这与他汀类药物增加Akt/ eAl(iA irii路活性相关’八平研究也发现瑞舒伐他汀井不能完全阻止高糖对微血管内皮细胞的影响，故说明高塘导致的L1tl.管形成障碍部分与[P131k/ A k t/ e\A(>d通路抑制相关

综上所述，本研究结果显示高糖抑制了微血管内皮细抱的管腔形成同时还降低了细胞的增zA.和迁侈能力瑞舒伐他汀可改善高糖对内皮细胞的影啊但L1294002可阻止瑞舒伐他汀的作用。此外，我们还发现在高糖培养基条件下细胞内Ia- 1kt和，)一。Ai 0 s的相对表达量明辙降低，同样是因为瑞舒伐他刊增加了这两种磷酸化蛋白的表达因此，我们初步推断瑞舒伐他汀改善高糖导致的血管形成障碍，其机制可能部分是通过l -.调PI3K/ Akt/elVOh通路来实现的、

参考文献

[1]Shah AM,Hung CL,Shin SH. Cardiac structure and function,remodeling,and clinical outcomes among patients with diabetes after myocardial infarction complicated by left ventricular systolic dysfunction,heart failure,or both[J].American Heart Journal,2011,(04):685-691.

[2]Song Q,An X,Li D. Hyperglycemiaattenuates angiogenic capability of survivin in endothelial cells[J].Microvascular Research,2009,(03):257-264.

[3]Landmesser U,Engberding N,Bahlmann FH. Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization,myocardial neovascularization,left ventricular function,and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase[J].Circulation,2004,(14):1933-1939.

[4]Boodhwani M,Sodha NR,Mieno S. Functional,cellular,and molecular characterization of the angiogenic response to chronic myocardial ischemia in diabetes[J].Circulation,2007,(11):Ⅰ31-Ⅰ37.

[5]于珮,于德民,齐建成. 高糖通过PI3 K-Akt信号途径抑制内皮细胞迁移和增殖及血管发生改变[J].中华医学杂志,2006,(48):3435-3430.doi:10.3760/j:issn:0376-2491.2006.48.010.

[6]Raphael J,Gozal Y,Navot N. Hyperglycemia inhibits anesthetic-induced postconditioning in the rabbit heart via modulation of phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and endothelial nitric oxide synthase signaling[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology and therapeutics,2010,(04):348-357.

[7]Naruse K,Rask-Madsen C,Takahara N. Activation of vascular protein kinase C-beta inhibits Akt-dependent endothelial nitric oxide synthase function in obesity-associated insulin resistance[J].Diabetes,2006,(03):691-698.doi:10.2337/diabetes.55.03.06.db05-0771.

[8]Sasso FC,Torella D,Carbonara O. Increased vascular endothelial growth factor expression but impaired vascular endothelial growth factor receptor signaling in the myocardium of type 2 diabetic patients with chronic coronary heart disease[J].Journal of the American College of Cardiology,2005,(05):827-834.doi:10.1016/j.jacc.2005.06.007.

[9]Wu J,Lei MX,Xie XY. Rosiglitazone inhibits high glucoseinduced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells through the PI3K/Akt/eNOS pathway[J].Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,2009,(07):549-555.

[10]Lee SJ,Namkoong S,Kim YM. Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf-1/MEK/ERK-and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2006,(06):H2836-H2846.

[11]Kureishi Y,Luo Z,Shiojima I. The HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin activates the protein kinase Akt and promotes angiogenesis in normocholesterolemic animals[J].Nature Medicine,2000,(09):1004-1010.

[12]Bitto A,Minutoli L,Altavilla D. Simvastatin enhances VEGF production and ameliorates impaired wound healing in experimental diabetes[J].Pharmacological Research,2008,(02):159-169.doi:10.1016/j.phrs.2008.01.005.

[13]Kikuchi R,Takeshita K,Uchida Y. Pitavastatin-induced angiogenesis and arteriogenesis is mediated by Notchl in a murine hindlimb ischemia model without induction of VEGF[J].Laboratory Investigation,2011,(05):691-703.

[14]Kobayashi T,Taguchi K,Nemoto S. Activation of the PDK-1/Akt/eNOS pathway involved in aortic endothelial function differs between hyperinsulinemic and insulin-deficient diabetic rats[J].American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology,2009,(05):1767-1775.

[15]Tian XY,Wong WT,Xu A. Rosuvastatin improves endothelial function in db/db mice:role of angiotensin Ⅱ type 1 receptors and oxidative stress[J].British Journal of Pharmacology,2011,(02):598-606.

[16]Prakash P,Khanna V,Singh V. Atorvastatin protects against ischemia-reperfusion injury in fructose-induced insulin resistant rats[J].Cardiovascular Drugs and Therapy,2011,(04):285-297.