糖尿病大鼠血糖波动模型的建立

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一组代谢异常综合征。因胰岛素分泌、胰岛素作用或两者同时存在缺陷，引起碳水化合物、蛋白质、脂肪、水和电解质等的代谢紊乱，临床以慢性(长期)高血糖为主要共同特征。近年研究表明，糖尿病慢性并发症的发生与发展不仅与整体血糖水平增高有关，而且与血糖波动密切相关，血糖波动越大，慢性并发症发生率越高[1-2]。建立可靠、稳定的糖尿病血糖波动动物模型，可为深入研究糖尿病血糖波动发病机制及临床治疗奠定基础。国外文献关于糖尿病波动血糖的报道主要集中在临床试验和体外细胞试验方面[3-4]，而关于糖尿病波动血糖模型的报道甚少;国内文献报道[5-8]，糖尿病波动血糖模型的建立方法多采用定时给予糖尿病大鼠胰岛素和(或)葡萄糖进行诱导。其中，胰岛素、葡萄糖的给予时间、次数等具体问题往往是影响动物模型成模率、死亡率的重要因素，这些问题以往的报道较少。本研究基于糖尿病大鼠日内血糖波动特点及大鼠血糖个体化差异特点，每日择时给予糖尿病大鼠2次胰岛素或葡萄糖，建立1日中血糖浓度大幅波动模型。并从大鼠一般情况、体质量、血糖、血清胰岛素水平、胰岛组织病理学改变等方面进行了综合评价，为研究波动血糖对糖尿病的影响提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley 大鼠65 只，雄性，体质量180± 20 g。由安徽省实验动物中心提供(动物质量合格证号：scxk(皖)2011-002)。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.2 试剂与仪器链脲佐菌素购自美国Sigma 公司;柠檬酸(FW： 210.14)及柠檬酸钠(FW：294.10)(天津市津宏化工有限公司生产);柠檬酸2.1 g加入100ml双蒸水中配成A液，柠檬酸钠2.94 g加入100 ml双蒸水中配成B液。STZ 必需4 ℃保存及新鲜配制;血糖仪及同批号血糖试纸(德国贝朗公司);普通胰岛素(江苏万邦生化医药);125Ⅰ 胰岛素放免试剂盒(中国原子能科学研究院同位素研究所)。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立方法大鼠自由饮水，在温度为22 ℃，相对湿度为50%的饲养环境中适应性喂养1周。随机取15只作为正常组(C)，其余大鼠禁食12 h后，用现配的柠檬酸缓冲液(0.1 mmol/L， pH 4.4)溶解STZ后，配成1%浓度，按50 mg/kg STZ腹腔注射诱发糖尿病。注射STZ72 h取大鼠尾静脉血，用血糖仪测定随机血糖值，(最大血糖值为33.3 mmol/L，更高的血糖值仪器显示为High，这种情况血糖值被当作为33.3 mmol/L)，造模10 d血糖稳定后，随机血糖水平 ≥16.7 mmol/L为造模成功的大鼠作为糖尿病模型组。

1.4 糖尿病大鼠血糖波动模型的建立方法 65只大鼠，15只作为正常对照，剩余50只接受了 STZ造模，随机血糖水平≥16.7 mmol/L最为造模成功的标准，按造模成功率80%，有10只大鼠未成模型。取糖尿病模型大鼠40只，随机选取7只检测1 d内8∶00、 12∶00点、16∶00点、18∶00点、20∶00点血糖值。然后将糖尿病大鼠随机分成持续高血糖组(SHG)、波动血糖组(IG)，每组各20 只，IG组大鼠每周检测2 次早8∶00和晚上18∶00的血糖值，根据大鼠这两时间点血糖值的高低，每日于早8∶00和晚上18∶00分别皮下注射1-3U普通胰岛素(血糖值≥16.7 mmol/L)，或灌胃葡萄糖2 g/kg 体质量(血糖值<16.7 mmol/L)。C组和SHG组大鼠以相同给药方式给予同体积生理盐水。共计6周。实验末次给药后禁食12 h，各组大鼠以戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉，腹主动脉抽血，离心取血清保存。

1.5 指标观察及检测方法 1.5.1 一般情况观察观察各组大鼠精神状态，毛色，体质量，进食，尿量等。每周测量体质量1次。 1.5.2 糖尿病大鼠1日血糖变化规律糖尿病大鼠血糖波动模型建立前，检测糖尿病大鼠1 d 内8∶00、12∶00 点、16∶00点、18∶00点、20∶00点血糖值，描绘血糖变化趋势曲线。1.5.3 各组大鼠1日5次血糖水平及量化血糖稳定性指标检测每周1次，测1 d内8∶00、10∶00、16∶00、18∶00、 20∶00血糖水平，并描绘血糖波动6周后各组大鼠1 d内 8∶00、10∶00、16∶00、18∶00、20∶00血糖变化趋势曲线。用血糖日平均水平(MBG)、日平均血糖的标准差(SDBG)、最大血糖波动幅度(LAGE，日内血糖最高值与最低值之差)量化各组血糖稳定性，计算血糖波动6 周后各组大鼠MBG 、SDBG、LAGE值。 1.5.4 空腹血清胰岛素(FINS)检测采用放免法。 1.5.5 胰腺HE检测试验结束后将大鼠处死，剖腹，取出胰腺组织，经10%中性甲醛液固定，常规石蜡包埋， 4 μm切片，行HE染色。光镜下观察胰腺形态学变化。 1.6 统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计。各组量化血糖稳定性指标、血清胰岛素数据进行正态分布检验，符合正态分布用单因素多水平设计定量资料的方差分析，并进行方差齐性分析，方差齐用LSD 检验，方差不齐用 Tamhane's T2检验，数据以均数±标准差表示;非正态分布进行多个独立样本非参数检验，数据以中位数(M)与四分位间距(Q)表示。大鼠各周体质量、大鼠1 d血糖变化用重复测量设计定量资料的方差分析。各种检验的显著性水平设定为P<0.05。

2 结果

2.1 一般情况造模后SHG组、IG组大鼠精神萎靡，行动迟缓，对外界反应迟钝，毛色无光泽，易脏，进食减少，饮水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，部分大鼠尿路感染，皮肤出现破损、溃疡、脓肿，其中，IG组症状更加明显，部分大鼠出现白内障表现。波动6 周后，C组大鼠死亡2 只，SHG 组、IG组大鼠各死亡7只。

2.2 血糖波动前后不同时间各组大鼠体质量变化(表1)重复测量两因素的方差分析检验结果显示：C组、 SHG组、IG组大鼠组间体质量差异无统计学意义(P>0.05);而各组大鼠在不同时间之间的体质量差别有统计学意义(F=27.09，P<0.01)。表1可看出，血糖波动造模开始时，IG 组体质量持续上升，4 周达高峰，然后下降。SHG组从血糖波动造模开始时间至2周，体质量亦持续上升，2周至4周体质量变化较平缓，4周后体质量又持续上升。C组体质量呈持续增加。

2.3 血糖波动实验前糖尿病大鼠1日血糖变化(图1)血糖波动实验前选取7只糖尿病大鼠，检测1日8∶00、 12∶00、16∶00、18∶00、20∶00血糖变化，5点时间血糖均数变化趋势图可看出糖尿病大鼠在8∶00、18∶00、20∶00 血糖处于较高水平，血糖在8∶00后呈下降趋势，在12∶00 降至低点，然后呈逐步上升趋势，1日内血糖平均水平值最高点在20∶00，血糖平均水平值最低点在12∶00。

2.4 血糖波动6周后各组大鼠1日5点时间血糖变化及 MBG、SDBG、LAGE(图2，表2)图2可看出，IG组血糖在8∶00较高，然后呈下降趋势至10∶00血糖降至最低，之后血糖持续上升至18∶00 达高峰，然后下降。在1日内形成2个明显的血糖波动高峰和低谷。SHG组血糖变化趋势较IG组相对平缓，在8∶00最高，然后下降，至10∶00血糖降至最低，之后持续呈上升趋势至20∶00达最高。C组1日内血糖变化幅度最小，基本保持稳定低值。单因素多水平方差分析显示：与C 组比较，SHG 组、IG 组大鼠MBG、SDBG、 LAGE明显升高，差异有统计学意义(P<0.01);与SHG 组比较，IG组大鼠SDBG、LAGE明显增高，MBG降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.5 血糖波动6周后各组大鼠FINS含量(表3)经多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验，血糖波动6 周后C 组、SHG 组、IG 组大鼠FINS 水平χ2= 14.673，P=0.001，3组大鼠FINS水平总体分布存在显著性差异，其中IG 组大鼠FINS 水平最低(平均秩 14.15)。SHG组、IG组大鼠FINS水平低于C组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，IG组、SHG组大鼠FINS 水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 各组大鼠胰腺组织形态学变化(图3) C组大鼠胰岛形态规则呈圆形，数量较多，细胞核呈圆形蓝色着染，胞质丰富浅粉色着染，胰岛表面有一层纤维膜包裹，与外分泌部之间界限清楚;外分泌腺泡细胞质内富含红染的酶原颗粒，细胞核呈深蓝色着染。SHG组和IG组大鼠均可见胰岛萎缩，β细胞数量减少，颗粒脱失，空泡变性，部分β细胞体积代偿性增大，细胞凋亡，伴有毛细血管扩张充血，血管壁增厚，周围结缔组织增生;外分泌部可见间质纤维增生，腺泡萎缩，萎缩部导管扩张，亦可见到间质脂肪细胞异位沉积、炎细胞浸润等现象。其中，在胰岛萎缩、间质脂肪细胞异位沉积方面，波动血糖模型较为多见，在胰腺腺泡萎缩方面，持续高血糖组较为多见。

3 讨论

文献报道用于制造血糖波动的糖尿病模型有单纯腹腔注射大剂量STZ(多为50 mg/kg以上)和高脂联合小剂量腹腔注射STZ两种方式[5-8]，高脂联合小剂量腹腔注射STZ形成的动物模型类似2型糖尿病特点，较单纯腹腔注射大剂量STZ而言，血糖水平低，且对高脂依赖性强，研究发现[9-10]高脂诱导时间太短或者STZ剂量太小都不易诱导大鼠成模，STZ诱导成功后若停用高脂饲料，空腹血糖5~7 d后又会恢复正常。基于波动血糖模型血糖波动的幅度及模型的成膜率和死亡率综合考虑，本试验选择一次注射STZ造成血糖相对较高的糖尿病模型，参考文献[11]采用50 mg/kg STZ，一次性腹腔注射诱发糖尿病模型，以血糖稳定10 d后，随机血糖水平≥16.7 mmol/L作为糖尿病大鼠模型成功的标准，成模率为80%。模型大鼠出现进食量、饮水、排尿明显增多，毛色无光泽，精神萎靡，行动迟缓等糖尿病症状。关于波动血糖模型的建立，有直接根据糖尿病模型大鼠空腹血糖变异系数(FBG-CV)的水平，将FBG-CV 水平较高者视为波动血糖模型[12]。但由于糖尿病大鼠1 日内血糖波动幅度并非很大，因此，多数文献报道的波动血糖模型则采用定时给予糖尿病大鼠胰岛素和(或)葡萄糖进行诱导。由于啮齿类动物进食具有不定时性，与人的饮食规律有本质的不同，单纯给予胰岛素有发生低血糖的风险，而实验过程中发现单纯口服给糖，血糖波动幅度又往往偏小。因此本实验采用择时给予适量胰岛素(血糖值高时)或灌胃葡萄糖(血糖值低时)的方式造模，既能保证血糖波动的幅度，亦能兼顾血糖个体化的差异，有效避免低血糖的发生。关于胰岛素的时间、次数，目前研究尚未统一，有1次/d(未明具体时间)[13-14]、8∶00、15∶00 2次[8]、7∶30、11∶30、15∶30 3 次注射[7]、未定次数等[5, 15]。为达到良好的造模效果，本实验根据糖尿病大鼠日内血糖波动特点确定胰岛素1 d 时间与剂量，考虑到大鼠昼伏夜动的生活习性，选择1日 8∶00、12∶00、16∶00、18∶00、20∶00 5个时间段监测血糖变化，结果显示糖尿病大鼠在8∶00、18∶00、20∶00血糖处于较高水平，12∶00降至最低，1 d内血糖平均波动幅度不大，血糖最高点与最低点差别在10 mmol/L之内。以这种日内血糖波动规律，实验选择8∶00、18∶00血糖高值处给予胰岛素，根据普通胰岛素皮下注射的药动学， 0.5 h开始起作用，2~3 h达作用高峰，造成了10∶00与20 ∶00血糖的降低，改变了DM大鼠的血糖波动曲线，使得 LAGE增加，形成了1 d中血糖浓度大幅波动模型。这样在血糖高值给予胰岛素，既能在1日内形成2个明显的血糖波动高峰和低谷，同时也尽可能避免了低血糖风险。实验中发现大鼠血糖有个体化差异，尤其是8∶00，部分大鼠血糖会偏低，因此，实验每周随机检测2 次8∶00 和18∶00的血糖值，并根据其个体化的差异确定给予胰岛素或葡萄糖的剂量，在形成波动血糖的同时，尽可能减少了大鼠的死亡率。胰岛素剂型、剂量的选择，文献报道多选择普通速效胰岛素或超短效胰岛素类似物诺和锐，一次剂量有 20、12~16 U、3 U/kg[7, 13, 15]不等，胰岛素在临床上作为糖尿病治疗药物通常是短效、长效制剂联用，三餐前以短效制剂控制餐后高血糖，并以长效制剂维持餐间及夜间的血糖水平，若未能合理应用则会造成血糖波动从而给人体带来不利后果。因此，使用胰岛素诱导血糖波动应避免其治疗作用，我们预实验发现，中长效胰岛素在降糖的同时，能使一日血糖保持恒定，不利于血糖波动的形成。因此，实验选择了短效胰岛素建立波动血糖模型，鉴于胰岛素每日应用的累积效应以及部分20 mmol/L以下血糖者有回复正常的可能，胰岛素剂量不能过大，实验中根据血糖的高低，选择皮下注射短效胰岛素1~3 U。研究结果表明造模6周后，IG组大鼠MBG明显高于正常组，SDBG、LAGE明显高于C组和SHG组，差异均有统计学意义(P<0.01)，说明波动血糖模型制作成功。有研究表明，链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠有胰岛萎缩，β细胞数量减少，部分β细胞体积代偿性增大，以及胰腺间质血管壁增厚，血管周围结缔组织增生，局灶性腺泡萎缩，间质纤维增生等胰腺病变[16]。对于1型糖尿病模型而言，还多伴有β细胞颗粒脱失，空泡变性，胰岛毛细血管扩张充血等表现;2型糖尿病模型则可较多出现β细胞凋亡，β细胞内及血管周围脂肪细胞异位沉积等病理现象。我们的实验发现成模的糖尿病大鼠胰岛组织病理学改变兼有1型和2型糖尿病的胰腺病变，这说明STZ直接破坏胰岛β细胞，使β细胞数量减少，其可能导致胰岛素分泌合成不足，使血糖升高，从而产生糖尿病，同时也证实了我们采用的50 mg/kgSTZ一次性腹腔注射诱发糖尿病模型的方法并非是绝对的1型或2型糖尿病模型，而是两者兼而有之。实验中，大鼠体质量在不同时间的差别有统计学意义(P<0.01)。血糖波动造模开始时，IG组大鼠体质量持续上升至4周达高峰，然后下降;SHG组体质量缓慢上升;C组体质量呈持续增加。而在C组、SHG组、IG组大鼠体质量间差异无统计学意义(P>0.05)。我们亦检测了3组大鼠FINS水平，发现在血糖波动6周后总体分布存在显著性差异(P<0.01)，SHG组、IG组大鼠FINS 水平低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)， IG组、SHG组大鼠FINS水平之间的差异则无统计学意义。实验发现持续高血糖模型大鼠体质量变化与胰岛素作用并不同步，胰岛素降低的同时体质量未见明显降低，推测以50 mg/L STZ造模诱发糖尿病仅能破坏部分胰岛β细胞。与之比较，波动血糖模型大鼠血清FINS水平降低更为明显，造模过程中体质量呈先升后降的变化，考虑可能随着时间推移，STZ和波动血糖损伤胰岛β 细胞的综合效应增强，胰岛β细胞破坏程度更重，导致残存胰岛细胞无法再发挥代偿作用，而使血糖和体质量逐渐降低。综上所述，定时给予糖尿病大鼠胰岛素或葡萄糖进行诱导建立的血糖波动模型有如下优点：(1)血糖升高幅度明显，重复性好;(2)成模后血糖值较稳定、自身缓解较少;(3)以糖尿病大鼠日内血糖波动特点确定造模时段，能提高模型成功率，降低低血糖风险;(4)根据血糖个体化的差异给予胰岛素或葡萄糖，可减少造模过程中的死亡率。但该模型要求每周检测1~2次血糖，周期较长，实验成本加大，给研究带来一定的不便，这也是此类造模方法尚待改进之处。此外，在STZ剂量的选择上，如何合理兼顾血糖波动的幅度、模型的成膜率和死亡率以及成膜后的糖尿病类型，亦是模型需要进一步探讨的问题。

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