小檗碱增加亲脂素在巨噬细胞的表达

　　作者：陈凤玲,杨志红,王宣春,刘瑜,杨叶虹　　作者单位：复旦大学附属华山医院内分泌科，上海 200040

　　【摘要】目的 观察小檗碱对人单核细胞系(THP1细胞)来源的巨噬细胞的亲脂素表达的影响，探讨小檗碱改善血脂紊乱的机制。方法 用佛波脂(TPA)诱导人THP1细胞，使之成为巨噬细胞，再用不同浓度(5 μmol•L-1、10 μmol•L-1、20 μmol•L-1、50 μmol•L-1)的小檗碱干预巨噬细胞，等体积的生理盐水为对照;分别采用逆转录-实时定量聚合酶链反应及免疫印记的方法观察小檗碱对巨噬细胞亲脂素的核酸和蛋白表达的影响。结果 5～20 μmol•L-1小檗碱明显增加人巨噬细胞亲脂素的表达(P<0.05)，呈浓度依赖性。结论 小檗碱增加人巨噬细胞亲脂素的表达，可能与其改善血脂紊乱和抗动脉粥样硬化有关。

　　【关键词】 小檗碱,巨噬细胞,亲脂素

　　Abstract: Objective To observe the effect of berberine on adipophilin expression in macrophage (THP1) and to probe the mechanism of improving blood fats disorder of berberine.Methods THP1 cells were induced into macrophages with 12otetradecanoylphorbol13acetate (TPA).Then macrophages were interfered with different density berberine(5 μmol•L-1,10 μmol•L-1,20 μmol•L-1,50 μmol•L-1).Isovolumic saline was used as control.The effect of berberine on nucleic acid and proteinum expression of adipophilin was detected by RTrealtime PCR and Western blot respectively.Results Berberine increases adipophilin expression in THP1 derived macrophages significantly and shows a dosedependent manner in concentration of 5～20 μmol•L-1.Conclusion Berberine increases adipophilin expression in macrophages and it may be correlate to improve blood fats disorder and antiatherosclerosis.

　　Key words: berberine;macrophage;adipophilin

　　小檗碱是中药黄连素的主要成分，作用广泛，临床用于腹泻、肠炎等多种疾病的治疗。最近研究发现其具有降血糖、纠正脂质代谢紊乱、改善胰岛素抵抗及抗动脉平滑肌细胞增殖和移行(抗动脉粥样硬化)的作用[14]。外周组织的巨噬细胞来源于血循环中的单核细胞，在胆固醇的逆向转运中起重要作用[5];巨噬细胞对外周胆固醇的逆向转运作用是机体在高脂血症状态下的重要代偿机制[5]。亲脂素(adipophilin)是近年来发现的与脂肪细胞的分化相关的蛋白，并在机体的组织中广泛表达[67]。最近的研究发现亲脂素参与巨噬细胞的胆固醇吞噬和转化并受到过氧化物酶体增殖体激活受体γ(peroxisome proliferatoractivated receptor γ， PPARγ)的调控[811]。本研究通过观察小檗碱对体外培养的巨噬细胞亲脂素表达的影响，探讨小檗碱改善脂质代谢紊乱的新机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物与试剂

　　盐酸小檗碱(Berberine,Ber,系化学对照品) 系中国药品生物制品检定所出品;胎牛血清、RPMI 1640 培养基、二甲基亚砜、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Gibco公司;佛波酯 (12otetradecanoylphorbol13acetate，TPA) 购自美国Sigma公司;硝酸纤维膜为华舜公司产品;X 光片购自Kodak 公司;人单核细胞株(THP1)购自中科院细胞生物研究所(系来自美国细胞和菌种库);RNA抽提试剂Trizol 购自Sigma 公司;蛋白抽提试剂RIPA购自申能博彩公司;亲脂素抗体(AP125)购自RDI公司;β肌动蛋白(βactin)抗体购自Santa Cruz公司;HRP偶联的羊抗鼠二抗购自Santa Cruz公司;PhototopeTMHRP Detection 试剂盒购自Cell Signaling公司。

　　1.2 细胞培养及诱导分化

　　THP1细胞株用RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清、25 mmol•L-1 HEPES)培养，接种于6孔板，细胞密度为每孔2×106，在RPMI1640培养基中加入160 nmol •L-1的TPA诱导48 h，观察细胞由悬浮状态转为贴壁生长，且具有明显的异形性成为巨噬细胞。

　　1.3 细胞干预

　　用加有10 μmol•L-1小檗碱(生理盐水为对照)的RPMI 1640培养基培养上述经过诱导48 h的巨噬细胞，分别在12 h、24 h、48 h、72 h后收取细胞，抽提细胞的总RNA和蛋白质，分别检测亲脂素的核酸和蛋白表达，观察小檗碱对巨噬细胞亲脂素的核酸和蛋白表达影响的时间性。之后用加有不同浓度(5 μmol•L-1、10 μmol•L-1、20 μmol•L-1、50 μmol•L-1)的小檗碱(等体积的生理盐水作为对照)的RPMI 1640培养基培养巨噬细胞，在24 h收取细胞，抽提细胞的总RNA用于检测不同浓度小檗碱对巨噬细胞亲脂素的核酸表达的影响;在48 h收取细胞，抽提细胞的总蛋白，用于检测不同浓度小檗碱对巨噬细胞亲脂素的蛋白表达的影响。

　　1.4 亲脂素的核酸表达水平检测

　　采用实时定量聚合酶链反应(RTrealtime PCR)方法检测巨噬细胞亲脂素的核酸表达水平。以Trizol 抽提巨噬细胞的总RNA，用1 μg总RNA进行逆转录。Realtime PCR用LightCycler 2.0 System仪器和配套的LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒(Roche公司)。用βactin 作为内参。以亲脂素的mRNA表达量与相对应的内参βactin的mRNA表达量的比值来表示亲脂素的相对表达量(实验重复3次，每次用3个复管，取其均值)。

　　1.5 亲脂素蛋白表达水平的检测

　　采用免疫印记(Westen Blot)方法检测巨噬细胞亲脂素的蛋白表达水平。用细胞蛋白裂解液RIPA裂解收取的巨噬细胞，提取细胞总蛋白。每个样本取100 μg蛋白上样，亲脂素抗体(AP125，鼠单抗)孵育浓度是1500，βactin抗体(鼠单抗)孵育浓度是1500。二抗(HRP偶联)孵育浓度是12 000。应用PhototopeTMHRP Detection 试剂盒，按照其操作进行显色，之后进行感光和胶片冲洗，应用灰度扫描仪分析亲脂素蛋白条带与对应的βactin条带灰度的比值表示亲脂素的相对表达量(实验重复3次，每次用3个复管，取其均值)。

　　1.6 统计学处理

　　结果以±s表示，采用t检验并应用SPSS 14.0统计分析软件进行统计。

　　2 结果

　　2.1 小檗碱增加巨噬细胞亲脂素的mRNA表达

　　RTrealtime PCR结果显示10 μmol•L-1浓度小檗碱(生理盐水为对照)干预后24 h巨噬细胞亲脂素的mRNA表达达到高峰(0.27)，为对照的2.43倍(图1A);不同浓度的小檗碱干预后24 h，5～20 μmol•L-1浓度的小檗碱明显增加巨噬细胞亲脂素的表达，且呈浓度依赖性， 20 μmol•L-1浓度小檗碱增加巨噬细胞亲脂素表达最显著(达0.33)，是对照的3.12倍(P<0.05)，而50 μmol•L-1浓度小檗碱干预后巨噬细胞亲脂素的核酸表达量却无显著增加(图1B)。

　　2.2 小檗碱增加巨噬细胞亲脂素蛋白的表达

　　WesternBlot结果显示，10 μmol•L-1浓度小檗碱(生理盐水为对照)干预后12 h巨噬细胞亲脂素的蛋白表达开始增加，在干预后48 h达到高峰(达0.23)，为对照的2.56倍(图2A);不同浓度的小檗碱(生理盐水为对照)干预后48 h， 5～20 μmol•L-1浓度小檗碱明显增加巨噬细胞亲脂素蛋白的表达，且呈浓度依赖性(图2B)， 20 μmol•L-1浓度小檗碱增加巨噬细胞亲脂素的表达最显著(达0.29)，为对照的3.43倍(P<0.05)，而50 μmol•L-1浓度小檗碱干预后巨噬细胞亲脂素的蛋白表达量却无显著增加。

　　3 讨论

　　亲脂素是近年来发现的与脂肪细胞分化相关的蛋白，在前脂肪细胞向脂肪细胞分化的过程中，亲脂素的表达量明显升高[6]。亲脂素在许多细胞及组织中均有表达[7]，而且游离脂肪酸、乙酰化的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、氧化的LDL等可以增加亲脂素的表达[12]。其表达定位在细胞浆的脂质小滴的包膜上，与脂质小滴的稳定有关[7]。最近的研究发现亲脂素在动脉粥样硬化斑块的富含脂质的泡沫细胞中高表达并且发现亲脂素在巨噬细胞的过表达可以促进巨噬细胞吞噬集聚胆固醇[8]。研究还表明亲脂素是PPARγ的靶基因，其启动子区含有PPARγ的反应元件。并且PPARγ的自然配体15脱氧δ前列腺素和人工合成的配体吡咯列酮和罗格列酮均能促进亲脂素的表达[911]。

　　本研究发现小檗碱可以增加人巨噬细胞亲脂素的表达。5～20 μmol•L-1浓度小檗碱增加巨噬细胞的亲脂素核酸和蛋白的表达呈浓度依赖性，20 μmol•L-1浓度小檗碱增加巨噬细胞亲脂素的核酸和蛋白的表达最显著，50 μmol•L-1浓度小檗碱干预后巨噬细胞亲脂素的核酸和蛋白表达量却无显著增加。其原因可能是高浓度的小檗碱对巨噬细胞产生毒性作用。小檗碱增加巨噬细胞亲脂素的表达与PPARγ激动剂增加巨噬细胞亲脂素表达的作用是一致的[9];此外，以往的研究发现在巨噬细胞中，小檗碱还可以增加白细胞介素12的表达，此与免疫调节功能有关，同时也与PPARγ激动剂的作用是一致的[12]。小檗碱增加巨噬细胞亲脂素及白细胞介素2的表达都与PPARγ激动剂类似，其机制有待进一步阐明;此外PPARγ激动剂通过调节ATP结合盒转运体A1(ATPbindingcassette transporter A1，ABCA1)的表达而加速内膜下巨噬细胞对胆固醇的摄取和逆向转运，加快巨噬细胞清除血管内膜下脂质[13];同时PPARγ激动剂抑制巨噬细胞炎症因子的表达和分泌，从而抑制动脉粥样硬化的发生和进展[14]。小檗碱是否也具有这些作用及相关的机制都有待进一步研究。

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