一株海南红树林真菌胞外多糖抗病毒活性初步研究

　　作者：裴　华，林英姿，饶朗毓，王永霞，牛莉娜，王华民，杨　文 作者单位：(海南医学院热带医学与检验医学院，海南 海口　571101)

　　【摘要】 目的：对分离自海南红树林真菌菌株PH1018的胞外多糖体外抗流感病毒H3N2和柯萨奇B组3型病毒( CoxB3) 活性进行研究。方法： 收集纯化菌株PH1018产生的胞外多糖，观察其细胞毒性和对抗病毒引起的细胞病变效应。菌株分类采用形态学观察和ITS序列分析。结果： 多糖样本可明显抑制流感病毒H3N2，细胞病变半数抑制浓度为34.32 μg/mL，选择指数达到41.3。CoxB3的IC50为7.81 μg/mL，选择指数达到212。菌株初步鉴定为杂色曲霉。结论： 从海南红树林分离一株杂色曲霉，其产生的胞外多糖在体外具有抗流感病毒H3N2和CoxB3活性，值得进一步研究。

　　【关键词】 真菌,胞外多糖,抗病毒作用;流感病毒; 柯萨奇病毒

　　[ABSTRACT] Objective： To explore antiviral activities of exopolysaccharide(EPS)from one kind of fungi strain PH1008 isolated from mangrove in Hainan province against H3N2 influenza virus and coxsackievirus (CoxB3) in vitro. Methods：The EPS of strain PH1018 was collected and purified. The toxicity and antiviral actions of EPS was evaluated by observing drug cytotoxicity effect and cytopathic effect(CPE). The taxonomic status of strain was identified by morphological observations and analysis of the ITS sequence. Results：The EPS inhibited H3N2 influenza virus at the IC50 values of 34.32 μg/mL， and SI values of 41.3. The EPS inhibited CoxB3 at the IC50 values of 7.81 μg/mL， and SI values of 212. The strain was identified as Aspergillus versicolor. Conclusions：EPS from fungi strain PH1018 isolated from mangrove in Hainan province has remarkable anti H3N2 influenza virus and CoxB3 activities in vitro， this EPS could be utilized for the further research.

　　[KEY WORDS] Fungi; Exopolysaccharide; Antiviral effect; Influenza virus; Coxsackievirus

　　红树林是生长在热带、亚热带海岸以红树植物为主体的潮滩湿地木本生物群落，具有丰富的真菌资源，目前已分离鉴定的红树林真菌超过200 种，成为海洋真菌的第二大类群。该生境中的真菌因沼泽化、盐渍化、强酸性、有机质含量高的生态环境，可能存在特殊的代谢途径并产生具有独特生物学功能的代谢产物[1]。本研究从海南岛红树林筛选分离可能产生抗病毒活性胞外多糖的真菌菌株，并对有价值的菌株进行初步鉴定。

　　1　材料与方法

　　裴华等.一株海南红树林真菌胞外多糖抗病毒活性初步研究

　　1.1　实验材料

　　MDCK细胞株、Vero细胞株、流感病毒H3N2、CoxB3均购自中国典型培养物保藏中心。DMEM培养基(购自GIBCO公司)，发酵培养基采用大豆粉玉米粉培养基(大豆粉10.0 g， 玉米粉10.0 g， 可溶性淀粉5.0 g， KH2PO4 0.5 g,50%陈海水定容至1 L，调pH 7.2)。查氏培养基、陈海水马丁培养基(50%陈海水配置、1 ‰氯霉素)，购自北京陆桥技术有限责任公司。新生牛血清购自杭州四季青工程材料有限公司。MTT购自Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

　　1.2　真菌胞外多糖的获取

　　1.2.1　真菌菌株的分离纯化

　　土壤样本采集于海南演丰红树林国家自然保护区表土下5～20 cm;称取10 g土壤样本，在无菌操作下加入100 mL无菌陈海水的三角瓶中，充分振荡混匀后，进行10倍稀释，取样本上清制备成10-2至10-4不同稀释度，各稀释度取100 μL涂布于分离培养基上，28℃培养，对平板上不同形态菌落进行编号并观察记录[2]。

　　1.2.2　胞外多糖成分分离获取

　　根据菌落形态特征，挑取单菌落接种于发酵培养基中，发酵5 d (250 r/min,28℃)。发酵液离心后 ( 3 000 r/min,4℃，20 min)取上清。发酵上清4℃ 6 520 g离心20 min后，上清液以3倍体积冰乙醇4℃沉淀。24 h后4℃条件下4 520 g离心15 min 后，沉淀溶于去离子水中。链蛋白酶+Sevag法联合脱蛋白[3]后，-50℃条件下冻干48 h后备用。

　　1.3　体外抗病毒实验

　　1.3.1　细胞的培养与增殖

　　处于对数生长期的细胞消化后用DMEM生长液稀释， 使其密度为2.5 ×105 mL。细胞接种于96孔板中， 每孔100 μL，于37℃、5% CO2培养箱中培养至长成单层细胞。

　　1.3.2　多糖的细胞毒性测定

　　待接种于96孔培养板的MDCK或Vero细胞长成单层后，加入EPS样品的对倍稀释液100 μL / 孔(7个浓度梯度，每个稀释度设4个平行)，同时设正常细胞对照组( 加100 μL的DMEM维持液)、阳性对照组(病毒唑对倍稀释后加入)。加样后的96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，每天观察，记录各浓度孔细胞毒性情况。每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，置于培养箱中4 h，弃孔中培养液，每孔加入10% 二甲亚砜100 μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养 8 h，用酶标仪测定OD值，测量波长为570 nm，参比波长为630 nm，计算多糖样品对细胞的半数毒性浓度(Cytotoxic concentration， CC50， μg/ mL) 及无毒界限浓度( Maximal non cytotoxic concentration， MNCC， μg/ mL)。

　　1.3.3　多糖的体外抗病毒活性初筛

　　将长有单层细胞的96孔板中培养液弃去，加入50 μL不同浓度的用维持液稀释的样品(最高浓度不超过MNCC)，随即加入50 μL100TCID50病毒悬液，每个样品浓度平行3孔，同时设正常细胞对照组(加100 μL维持液) 、病毒对照组(加入50 μLTCID50的病毒悬液和50 μL维持液) 和阳性药物对照组(加50 μL对倍稀释的病毒唑和50 μL100TCID50 的H3N2 influenza virus /CoxB3病毒悬液)。37℃、5 % CO2 培养箱中培养，每天观察由病毒引起的细胞病变效应(Cytopathic Effect， CPE)。当病毒对照组出现75% ～100 % CPE，而正常细胞对照组正常时，记录各孔的CPE，求出各样品对细胞病变的半抑制浓度(Inhibited concentration， IC50)和选择指数(Selectivity Index， SI ，SI = CC50/IC50)。(“-”为0 % CPE， “+”为1 %～25 % CPE，“++”为25 %～50 % CPE，“+++”为50 %～75 % CPE，“++++”为75 %～100 % CPE)[5]。

　　1.4　菌种分类鉴定

　　对上述实验中胞外多糖具有较强抗流感病毒H3N2、CoxB3活性的菌株进行形态学观察;同时对菌株ITS序列进行测序并构建系统发育分析[6]。

　　1.5　统计学处理

　　试验所得到的数据用统计软件SPSS13.0的Probit回归法计算EPS的CC50和IC50，并计算出SI。菌株ITS序列测序结果与Genbank中核酸序列进行比对，并利用Clustal W软件序列进行分析，然后采用邻近-连接法(Neighbour Joining method)聚类，生成系统聚类树，并用Bootstrap软件对系统发育树进行检验。

　　2　结果

　　2.1　体外抗病毒实验

　　研究共分离得到真菌437株，其中菌株PH1018胞外多糖在体外有较强的抗流感病毒H3N2和CoxB3效果。表1　 菌株PH1018胞外多糖体外抗流感病毒H3N2活性、抗CoxB3活性,抗流感病毒H3N2活性

　　2.2　菌株PH1018分类鉴定

　　菌株PH1018接种在查氏琼脂平板上7 d直径约19 mm的菌落。菌落呈墨绿色，质地丝绒状，呈辐射环向外生长;反面颜色为黄褐色。显微镜下观察其分生孢子梗顶端膨大形成半球形顶囊，分生孢子头呈疏松辐射状。对其ITS序列进行分析，结合NCBI数据库中的相关数据，运用Clustal W软件构建系统发育树。根据形态学观察结合ITS序列分析结果，初步将菌株PH1018归属于半知菌亚门曲霉属杂色曲霉(Aspergillus versicolor)，见图1。图1.　基于ITS序列的菌株PH1018与相关菌株系统发育树

　　3　讨论

　　近年来，针对红树林真菌代谢产物的生物学活性研究大量展开。多种真菌及其代谢产物的抗菌、抗肿瘤等生物学效应被大量报道。本研究自海南演丰红树林国家自然保护区土壤样本分离获得437株真菌菌株，其中一株杂色曲霉产生的EPS经初步体外抗病毒试验，发现具有抗流感病毒H3N2和CoxB3活性，目前尚未有相关文献报道。后续将对此EPS抗病毒活性及结构特点进行深入研究探索。

　　当前多项针对红树林土壤及植物部分微生物的资源调查和生物活性评价研究表明：红树林土壤中大部分微生物尚未被分离培养[7]。红树林地区真菌资源进行更详尽的调查和生物活性评价，将可能为新药物的研究开发提供重要资源。

　　【参考文献】

　　1　Cheng ZS，Pan JH， Tang WH， et al. Biodiversity and biotechnological potential of mangrove-associated fungi [J]. Forestry Research， 2009,20(1)：63–72.

　　2　缪承杜， 庄令， 林海鹏， 等. 海南文昌清澜港红树林真菌抗B16肿瘤细胞活性菌株的筛选[J]. 生物工程学报， 2008， 24(6)： 975-979.

　　3　 Swén E， Huttunen E， Zhang X， et al. Structural analysis of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus ST1 solely by NMR spectroscopy [J]. Biomol NMR， 2010， 47(2)：125-134.

　　4　张颖，岑颖洲，黄日明，等.南海七种海藻多糖的抗病毒活性初步研究[J].病毒学报，2006,22(4)：282-285.

　　5　夏乾峰，谭河林，覃西，等.方格星虫多糖抗乙型肝炎病毒的实验研究[J].山东医药，2010,50(7)：44-45.

　　6　饶朗毓，陈政良，牛莉娜.一株具免疫增强活性红树林真菌的筛选及鉴定[J].中国热带医学，2011,11(6)：683-685.

　　7　杨晓洪，顾觉奋. 红树林土壤微生物与其代谢产物研究进展[J].国外医药抗生素分册，2011,32(3)：97-134.