G蛋白β3亚单位基因C825T多态性与2型糖尿病合并大血管病变的关系

　　作者：余本富,陈明卫,王佑民,潘发明　　作者单位：合肥市第三人民医院内分泌科(佘本富) 230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院内分泌科(陈明卫，王佑民) 　230032 合肥 安徽医科大学公共卫生学院(潘发明)

　　【摘要】目的探讨合肥地区汉族人群G蛋白β3亚单位基因C825T多态性(GNβ3C825T)与2型糖尿病(T2DM)合并大血管病变(MA)的遗传易感性。方法 采用聚合酶链反应结合限制性内切酶片段长度多态分析方法(PCR-RFLP)检测293例合肥地区汉族T2DM患者GNβ3C825T多态性，并测定T2DM患者的体质指数(BMI)、腰臀比(WHR)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(P2hPG)、胰岛素敏感指数(ISI)等指标。结果 T2DM无MA组GNβ3C825T中基因型频率(CC为30.6%，CT为50.0%，TT为19.4%)、等位基因频率(C为55.6%，T为44.4%)与T2DM有MA组基因型频率(CC为29.3%，CT为48.8%，TT为21.9%)、等位基因频率(C为53.7%，T为46.3%)分布差异无统计学意义，在调整年龄、性别、吸烟、高血脂、高血压后，Logistic回归分析显示在糖尿病人群中MA与GNβ3C825T无关。结论 合肥地区汉族人群中GNβ3C825T多态性可能与T2DM合并MA遗传易感性无关。

　　【关键词】 糖尿病Ⅱ型,基因多态性,并发症;危险因素; G蛋白β3亚单位基因

　　[Abstract] Objective To explore the heredity susceptivity between C825T polymorphism of human G-proteinβ3 subunit gene in the Chinese Han population with type 2 diabetes mellitus(T2DM) complicated by macro-vascular(MA) disease in Hefei area. Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was used to test the polymorphism of GNβ3C825T of 293 T2DM patients (41 case with MA).AT the same time, record T2DM patients' body mass index(BMI),waist-hip ration(WHR),systolic blood pressure(SBP),diastole blood pressure(DBP), fasting blood glucose(FBG),blood glucose of postprandial 2 hours(2hPG) and insulin sensitive index(ISI).Results The genotype frequency and allele frequency of T2DM without MA group were respectively CC/CT/TT=30.6%/50.0%/19.4%, C/T= 55.6%/44.4%; while the genotype frequency and allele frequency of T2DM with MA group were respectively CC/CT/TT=29.3%/48.8.0%/21.9%,C/T=53.7%/46.3% . there were no significant difference frequencies in genotype and allele of GNβ3 between two groups.After adjusting factors such as age, gender, smoking, hyperlip, and hypertension, stepwise multivariate unconditional logistic regression analysis showed the GNβ3C825T polymorphism was not related to T2DM with MA.Conclusion The GNβ3C825T polymorphism has no heredity susceptivity to MA among T2DM patients in the Chinese Han population of Hefei region .

　　[Key words] Diabetes mellitus typeⅡ; Gene polymorphism; Complication; Risk factors; G-proteinβ3 subunit gene

　　G蛋白是一组具有GTP结合、水解活性的蛋白质，在细胞膜受体和效应蛋白之间的信息传递过程中起中介作用。近年来研究发现，GNβ3C825T多态性与原发性高血压(essential hypertension，EH)、肥胖、2型糖尿病、血脂的相互关系存在分歧，而EH、肥胖、T2DM、高血脂等均是大血管病变的高危因素。本研究旨在探讨合肥地区汉族人群2型糖尿病人群中GNβ3C825T多态性与T2DM合并MA相关性 。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象 本文研究对象来自于2002年11月至2003年4月间安徽医科大学第一附属医院门诊及住院T2DM患者293例，其中102例合并EH、合并MA者41例。研究对象的一般特征见表 1。

　　1.2 诊断标准 根据1993年WHO/ISH动脉性高血压诊断标准：SBP≥140 mmHg和(或)DBP≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa);T2DM诊断标准：1999年WHO发表的空腹血浆血糖(FBG)≥7.0 mmol/L或(和)餐后2 h血浆血糖(2 h PG)≥11.1 mmol/L或OGTT 2 h PG≥11.1 mmol/L，排除其他类型糖尿病。符合下列三者之一或以上者定义为MA：①有心绞痛或心前区不适史并经动态心电图或运动平板试验证实有心肌缺血;或有心肌梗死史;或已确诊过为冠心病者;②有明确的脑血管病病史或经CT或MRI证实为脑缺血性或出血性病灶;③有下肢血管彩色多谱勒证实有动脉血管壁粥样硬化、狭窄或闭塞。

　　1.3 方法 PCR-RFLP分析

　　1.3.1 试剂 耐热Tap酶、10×buffer、10 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mgcl2(以上由华美生物工程公司提供)，引物(上海晶美生物工程公司提供)，BseDI内切酶、10×buffer(MBI公司提供)

　　1.3.2 血标本DNA提取 抽取受试者静脉血5 ml加入EDTA抗凝剂，离心、分离白细胞，用标准盐沉淀法提取各研究对象血标本DNA，并测定其OD值。

　　1.3.3 聚合酶链反应 根据GeneBank GNβ3基因特异序列，在网上设计引物：正义链5′-TGACCCACTTGCCACCCGTGC-3，，反义链5，-GCAGCAGCCAGGGCTGGC-3′，扩增片段大小为268 bp。PCR反应体系：Taq酶1.8 U，DNA 250 ng，上下游引物各220 pmol，dNTP 2.5 mmol，Mgcl2 2 mmol，10×buffer 5μl，加ddH20至50 μl，PCR反应条件：94.0 ℃预变性1 min，继而94.0 ℃变性45 s，61.0 ℃退火45 s，72.0 ℃延伸1 min共30个循环，最后72.0 ℃延伸4 min。PCR产物取2 μl，加Loading buffer 2 μl混匀，2%琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm)30 min，紫外线透射灯观测电泳条带分子量大小，见图1。

　　1.3.4 限制性核酸内切酶BseDI酶切反应 反应体系：BseDI 1.5 U，10×buffer 1 μl，PCR产物2 μl，加ddH2O补至总反应体积10 μl，55 ℃温育4 h后加10×Loading buffer 2 μl,终止酶切反应，2%琼脂糖凝胶电泳(5 V/cm)30 min，紫外线透射灯下观测酶切产物电泳条带及分子量大小来判读基因型，其中野生纯合型带形为2条带，片段大小分别为116、152 bp;杂合突变型带形为3条带，片段大小分别为116、152、268 bp;纯合突变型带形为1条带，片段大小为268 bp，见图2。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件将数据进行统计处理，正态分布数量资料两组之间比较采用t检验，组间频率比较采用χ2检验。以是否合并MA为因变量，以相关危险因素(二分类变量和区间变量)为自变量进行非条件Logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 临床资料

　　2.1 一般资料 研究对象一般临床特点在MA组中高血压、吸烟、高血脂、年龄、糖尿病病程、SBP、DBP高于对照组(P<0.05)，男、女比例等一般临床特点差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

　　2.2 基因型频率、各位其因频率 GNβ3C825T多态性在各组间的分布2组基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。GNβ3基因型在2组人群中的分布差异无统计学意义(χ2=0.142，P=0.932)，等位基因频率在2组人群中的分布差异亦无统计学意义(χ2=0.103，P=0.749)。见表2。

　　2.3 Logistic回归分析 非条件Logistic回归分析提示，在本组人群中调整年龄、性别、吸烟、是否合并高血脂、高血压后GNβ3C825T多态性与T2DM合并MA统计学上相关无统计学意义(P=0.850)。见表3。表1 研究对象一般资料CON组MA组PN(男/女)基因型和等位基因频率比较基因型频率CCCTTT等位基因频率CTCON组(252例)7712649280224 MA(41例)122094438 注：基因型频率比较：χ2=0.142，P=0.932;等位基因频率比较： χ2=0.103，P=0.749

　　3 讨论

　　人类G蛋白β3亚单位(GNβ3)位于染色体12p13[1]，长约7.5 kb，由11个外显子和10个内含子组成(编码蛋白区及其9个外显子)，编码蛋白含有340个氨基酸，分子量为37 kDa。GNβ3C825T多态性研究显示了携带T等位基因造成了外显子9转录的RNA核苷酸系列第498-620 bp的缺失，引起其编码的41个氨基酸的减少，从而改变了G蛋白β亚基7个WD螺旋结构，使第3个WD结构域中的后4个氨基酸及第4个WD结构域中的前37个氨基酸缺失，形成由6个WD螺旋组成的GNβ3-S，引起β亚基结构的改变。国内外研究提示，GNβ3基因C825T多态性与胰岛素抵抗[2]、高血压[3，4]、肥胖[5]等明显相关，甚至与代谢综合征有关[6]。但也有不同的观点：发现GNβ3 C825T多态性与高血压[7，8]、肥胖[8]、糖尿病[9]无关，认为可能与地域、人种有关。目前研究认为年龄、性别、高血脂、高血压、吸烟、糖尿病是动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化的危险因素[10]，也是 MA的主要危险因素。本人群中糖尿病合并大血管病变组中和无大血管病变组比较：年龄、性别、是否合并高血压、高血脂、吸烟及血压的高低有关。在调整年龄、性别、高血脂、高血压、吸烟影响因素后，合肥地区汉族人群GNβ3C825T多态性与2型糖尿病合并MA无明显相关性。

　　综上所述，合肥地区汉族人群中GNβ3C825T多态性与2型糖尿病合并MA无关。

　　【参考文献】

　　[1] Ansari-Lari MA, Muzny DM, Jing Lu, et al.A gene rich cluster between the CD4 and triosephate isomerase genes at human chromosome 12p13.Genome Res,1996;6:314-326.

　　[2] Esteban P,Vicente G,Daniel G, et al.Association of the G proteinβ3 subunit T allele with insulin resistance in essontial hypertension. Hypertension, 2002,24(5): 345-353.

　　[3] Siffert W, Rosskopf D, Siffert G, et al. Association of a human G-proteinβ3 subunit variant with hypertension. Nat Genet, 1998,18(1):45-48.

　　[4] 陈燕燕，李光伟，李春梅,等.G蛋白β3亚单位C825T与高血压、胰岛素抵抗及肥胖的关联.中华医学杂志,2003,83(14):1229-1232.

　　[5] Siffert W,Forster P,Jockel KH,et al.Worldwide Ethnic Distribution of the G Protein β3 subunit C825T Allele and Its Association with obesity in Caucasian, Chinese, and Black African Individuals.J Am Soc Nephrol,1999,10:1921-1930.

　　[6] 路方红,刘振东,赵颖馨.G蛋白β3亚单位C825T基因多态性与代谢综合征的关系.新医学，2008,39(3):161-163.

　　[7] Eva Brand,Herrmann SM,Viviane Nicaud,et al.The 825C/Tpolymorphism of the G-protein subunitβ3 is not related to hypertension. Hypertension,1999,5:1175-1178.

　　[8] Snapir A, Heinonen P, Tuomainen T,et al.G-proteinβ3 subunit C825T polymorphism:no association with risk for hypertension and obesity.J Hypertens,2001, 19(12): 2149-2155.

　　[9] 余本富,陈明卫,王佑民,等.G蛋白β3亚单位基因C825T多态性与2型糖尿病的关系.安徽医科大学学报,2004,39(4):267-269.

　　[10]陆再英,钟南山.内科学.7版.北京：人民卫生出版社，2008：267-268.