载脂蛋白E基因多态性与2型糖尿病合并脑梗死的关系

　　作者：韩峰,任建民,刘晓丽,郑淑婷,杨丽1　　作者单位：章丘市人民医院内分泌科， 济南 250200

　　【关键词】糖尿病,非胰岛素依赖型,血脂异常;脑梗死;载脂蛋白E基因;多态性

　　To explore the relationship between apolipoprotein E (ApoE) gene polymorphism and dyslipidemia as well as arteriosclerotic cerebral infarction (ACI )in type 2 diabetic patients. Methods 136 patients with type 2 diabetes mellitus, 64 patients with ACI and 72 patients without ACI, and 60 healthy controls were determined for the ApoE gene polymorphism by PCRRFLP. Results ① Differences of distribution frequency in genotype and allelomorphic gene between type 2 diabetic patients and controls were insignificant. ② The TC and LDLc levels in group ∈4 were the highest while the lowest were in group ∈2 (P<0.01). ③ 11 cases of the ∈4 allelle were found in the type 2 diabetic group with ACI and 4 were found in the type 2 diabetic group without ACI (χ2=4.672，P<0.05). Conclusion The ApoE ∈4 allele is related to hyperlipoidemia and the ∈4 allele is possibly a risk factor of type 2 diabetes mellitus.

　　Key words： Diabetes mellitus, Noninsulindependent; Dyslipidemia; Arteriosclerotic cerebral infarction; Apolipoprotein E gene; Polymorphism

       2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)常合并血脂代谢异常，T2DM脂代谢紊乱与大血管并发症密切相关，而大血管病变是T2DM患者致死、致残的主要原因。载脂蛋白E(ApoE)在血浆脂蛋白代谢及组织内脂质运转中起重要作用，其结构基因位点上有3个共显性等位基因∈2、∈3、∈4，由此构成人群中6种基因型，即3种纯合子∈2/2、∈3/3、∈4/4和3种杂合子∈2/3,∈2/4和∈3/4[1]。目前对ApoE基因多态性与T2DM血脂、大血管并发症关系的研究多集中于冠心病的研究，而对T2DM合并脑梗死(ACI)的研究较少。本研究旨在探讨ApoE基因多态性与山东汉族T2DM患者血脂水平及其脑梗死并发症的关系，以期为DM血脂异常的防治、DM脑血管病变的早期诊断及治疗提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 随机选择2006年2月至2007年5月于章丘市人民医院及山东大学齐鲁医院门诊或住院的T2DM患者136例为T2DM组，35～72岁，平均(54.39±8.68)岁，其中男76例，女60例，均符合1997年ADA的DM诊断标准。136例T2DM患者中合并ACI者64例设为T2DM合并ACI组，37～71岁，平均(55.32±9.64)岁，其中男35例，女29例，ACI诊断均符合1995年第四届全国脑血管疾病学会修定标准，72例未合并ACI者为T2DM未合并ACI组，36～69岁,平均(53.82±6.84)岁，其中男38例，女34例。正常对照组60例，35～69岁，平均(53.3±9.45)岁，其中男33例，女27例，来自健康查体者，均为无血缘关系的山东汉族人，排除心脏、肾脏、甲状腺等疾病。测量所有受试者的ApoE基因型及糖尿病组总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白A(ApoA)、载脂蛋白B(ApoB),空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)和血压(SBP、DBP)及身高体重、腰围、臀围，计算体重指数(BMI= 体重/身高2?Kg/m2)与腰臀比(WHR=腰围/臀围)，询问并记录T2DM组病程。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集 当日清晨空腹采集静脉血10?mL，取3?mL用于测定血脂、血糖等生化指标，其余血样加EDTA抗凝剂后保存于-80?℃冰箱中，用于DNA分离、PCR扩增、测序以及ApoE多态性分析。

　　1.2.2 DNA提取 应用大连宝生物公司提供的DNA快速提取试剂盒(Genome DNA Extraction kit)提取人类基因组DNA，将提取的DNA置-80?℃冰箱保存待用。

　　1.2.3?PCR扩增 采用PCRRFLP法，引物位于ApoE基因第4外显子内，涵盖两个多态性位点，上游引物:5′AACAACTGACCCCGGTGGCG3′;下游引物：5′ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC3′，由大连宝生物公司合成。

　　PCR反应体系：总体积50?μL，其中模板DNA 1?μg、引物各30?pmol、dNTP200?μmol/L Mgcl2?mmol/L、10×PCRbuffer 5?μL、二甲亚砜4?μL，加入双蒸水至50?μL， PCR扩增仪扩增，反应条件为94?℃预变性12?min，再94?℃ 1?min，70?℃ 2.5?min 5个循环，加入TaqDNA聚合酶2?U(0.4?μL),之后94?℃ 1?min、65?℃ 1?min、72?℃ 1?min，共30个循环，最后72?℃延伸10?min，扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳，检测是否有特异性的PCR扩增产物。

　　1.2.4 酶切及电泳 取PCR产物8?μL，HhaⅠ1?μL 酶解反应缓冲液2?μL，蒸镏水9?μL，总反应体系20?μL，于37?℃水浴4?h，取酶切产物10?μL进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(19∶1)120?V，电泳4?h，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

　　1.2.5 TG、HDL、LDL、TC、FBG、PBG及HbA1c测定 TG、HDL、TC采用酶法，LDL采用Friendewald 公式(TCHDLTG/2.2)计算，ApoA、ApoB测定采用免疫法，血糖测定采用葡萄糖氧化酶法，HbA1C 用DCA2000测定仪测定(批间CV<2%、批间CV<5%)。

　　1.3 统计学处理 计数资料采用χ2检验，计量资料采用±s表示，样本均数比较采用t检验和方差分析，两两比较采用q检验，以上处理均采用SPSS10.0统计软件进行。

　　2 结 果

　　2.1 ApoE基因多态性的检测结果 运用PCRRFLP方法测序，共检出6种ApoE基因型。①∈2/2：91、83、61?bp;②∈2/3型：91、83、61、48、35?bp;③∈2/4型：91、83、72、61、48、35?bp;④∈3/3型：91、61、48、35?bp;⑤∈3/4型：91、72、61、48、35?bp;⑥∈4/4：72、61、48、35?bp，见图1。

　　2.2 DM组与对照组基因型及等位基因频率分布 T2DM组及对照组基因型分布见表1。ApoE等位基因频率见表2。由表2可见，两组间基因型与等位基因分布频率均无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　ApoE基因位于第19号染色体上，由4个外显子和3个内含子组成，3种异构体ApoE2、ApoE3和ApoE4分别由∈2、∈3和∈4等3种等位基因编码，现在比较一致的认识是, ∈3为野生型基因, ∈2和∈4为突变型基因,而后2种等位基因对血脂有重大影响[2]。本研究在T2DM组及健康对照组均检测到ApoE基因的6种基因型，T2DM组及健康对照组均以∈3/3基因型及∈3等位基因为主，ApoE基因型及等位基因频率在T2DM患者及健康对照组中分布差异统计学意义(P>0.05);ApoE基因多态性与血脂异常密切相关，表明携带∈4等位基因的DM个体其TC及LDLC水平均较高，相反，携带∈2等位基因的2型DM个体TC及LDLC水平较低(P<0.01)。与国内外研究结果一致[34]。

　　不同的ApoE等位基因对血脂影响的作用机理可能为∈2、∈3、∈4与受体结合的活性存在明显的差别，∈2与ApoE受体及LDL受体的亲和力仅为∈3的2%，因此携带∈2者其血浆内CM残粒和VLDL残体浓度升高，ApoE介导的VLDL分解为LDL的速度降低，且由于LDL受体上调造成LDL外周代谢速度增快，通过LDL受体介导的肝细胞内吞LDL速度亦增快，造成∈2携带者其血TC及LDLC水平的下降[5]，相反，∈4与ApoE受体及LDL受体的亲和力较∈3为高，可通过上述代谢途径造成∈4携带者其血TC及LDLC水平的升高。但本研究结果显示，TG、HDL、ApoA、ApoB等水平在不同基因型之间无显著性差异，与郑以漫等研究结果一致[6]。

　　目前很多研究已证明，∈4基因是Alzheimer病的易感基因,还可能与冠状动脉粥样硬化性心脏病有关,但与脑梗死的关系仍不十分明确。Schneider等[7]及王景华等[8]均报告了∈4是脑梗死的危险因素。ApoE基因多态性可能通过下列方式影响脑梗死发病: ①影响血脂、脂蛋白水平从而促进动脉粥样硬化的形成;②通过影响巨噬细胞的作用和泡沫细胞的形成及作用于脂蛋白的结构蛋白直接参与动脉粥样硬化的形成;③通过影响神经细胞损伤后神经支配功能的恢复而导致神经细胞功能障碍。本研究结果显示，T2DM患者∈2组ACI的发生率为55.6%，∈3组为42.6%，∈4组为73.3%，携带∈4等位基因的T2DM患者其ACI发生的危险性较其它等位基因组为高，提示，T2DM患者中∈4携带者具有较高的ACI易感性、等位基因∈4携带者是T2DM合并ACI的易感人群。这一研究结果为脑梗死的基因治疗提供了一定的依据。

　　【参考文献】

　　[1] Dzimiri N, Meyer B F, Hussain S S, et al. Relevance of apolipoprotein E polymorphism for coronary artery disease in the Saudi population[J]. Arch Pathol Lab Med, 1999, 123(12):12411245.

　　[2] Kalina A, Szalai C, Prohaszka Z, et al. Association of plasma lipid levels with apolipoprotein E polymorphism in type 2 diabetes[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2002, 56(1):6368.

　　[3] Saito M, Eto M, Kaku K. Remanlike lipoprotein particle in type 2 diabetic patients with apolipoprotein E3/3 and apolipoprotein E2 genotypes[J]. Metabolism, 2002, 51(8):964969.

　　[4] 张雪梅, 刘秉文, 白怀, 等.中国人内源性高甘油三酯血症载脂蛋白E基因多态性的研究[J].中华医学遗传学杂志, 2001,18(2):100104.

　　[5] Mahley R M. Apo E:cholesterol transport protein with expending role in cell biology[J]. Science, 1988, 240(4852):3439.

　　[6] 郑以漫, 孙荣, 李小英, 等.ApoE基因多态性国人非胰岛素依赖型糖尿病血脂水平的关系[J].中华医学遗传学杂志，1997,14(3):142145.

　　[7] Schneider J A, Bienias J L, Wilson R S, et al. The Apolipoprotein Eε4 Allele Increases the odds of Chronic cerebral infarction detected atautopsy in older persons[J]. Stroke, 2005, 36(6):954959.

　　[8] 王景华, 宁宪嘉, 卢红艳, 等.脑梗死患者载脂蛋白E基因多态性特点研究[J].中国综合临床, 2006,22(2):118120.