山莨菪碱对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化的抑制

　　作者：唐云海， 朱春玲 作者单位：(贵阳医学院附院 肾内科， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 探讨山莨菪碱对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化(RIF)的影响及机制。方法： 将27只SD大鼠随机分为假手术组(SHAM，S组)、模型组(UUO，U组)及山莨菪碱治疗组(A组，14 mg·kg-1·d-1)。U组和A组采用单侧输尿管结扎术(UUO)制作肾小管间质纤维化的动物模型。术后第11天处死大鼠，肾组织HE染色及Masson染色后进行图像分析，评定各组肾小管间质损害及肾间质纤维化状况;用免疫组织化学方法检测各组大鼠肾间质的转化生长因子β1(TGFβ1)的表达。结果： U组肾小管间质损伤指数(TDI) 及肾间质纤维化指数(TFI)均明显高于S组(P<0.01);U组TGFβ1的表达均明显高于S组(P<0.01);A组的上述各指标分别较U组降低(P<0.05);TDI、TFI分别与TGFβ1的表达呈正相关。结论： 山莨菪碱对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化具有一定的抑制作用，其机制可能是抑制肾间质细胞TGFβ1的表达而在一定程度上减轻了RIF。

　　【关键词】 山莨菪碱; 纤维化; 肾; 转化生长因子β; 大鼠，SpragueDawley; 肾间质纤维化

　　An Experimental Study on the Inhibitory Effect of Anisodamine toRenal Tubulointerstitial Fibrosis in Obstructive Nephropathy Rats

　　TANG Yunhai, ZHU Chunling

　　(Department of Nephrology and Rheumatism, The Affiliated Hospital

　　of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To observe the influence of anisodamine to renal tubulointerstitial fibrosis of obstructive nephropathy rats and its possible mechanism. Methods: Renal interstitial fibrosis (RIF) models were established by Unilateral Ureteral Obstruction (UUO) method. Twentyseven male SpragueDawley rats were randomly divided into 3 groups: shamoperated group (group S), UUO group (group U) and anisodamine (14 mg·kg-1·d-1) treated group (group A). All of the rats were killed on the 11st day of the experiment. Sections of renal tissue were stained with HE or Masson methods, and image analysis was carried out to evaluate the damage in renal tubulointerstitium and the fibrosis of renal interstitium. The expression of transforming growth factorβ1 (TGFβ1) was determined with immunohistochemistry method. Results: Tubulointerstitial damage index (TDI), tubulointerstitial fibrosis index (TFI), and expression of TGFβ1 in group U were significantly higher than those in group S (P<0.01). These indexes were obviously lower in group A than those in group U (P<0.05). TDI and TFI positively correlated with expression of TGFβ1 respectively. Conclusions: Anisodamine has inhibitory effect to RIF, and the possible mechanism might be that anisodamine inhibits the expression of TGFβ1, which leads to the relief of renal tubulointerstitial fibrosis to some extent.

　　[Key words] anisodamine; fibrosis; kidney; transforming growth factor beta; rats,Spraguedawley; renal tubulointerstitial fibrosis

　　肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis, RIF)几乎是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同通路，是导致慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)的病理学基础。目前临床上山莨菪碱(anisodamine,Ani,6542,C17H23NO4)用于肝硬化腹水、肾小球肾炎等80余种疾病的治疗，且大多疗效良好。罗琳等[1]研究发现，Ani可改善肝纤维化和肝硬化症状。但Ani在RIF防治方面的探讨，目前尚无相关报道。积极寻找干预RIF进展的方法和一些药物治疗的新思路在延缓慢性肾脏疾病发展和改善RIF上具有重大意义。本次实验选用UUO动物模型，观察Ani能否改善肾间质纤维化程度以及下调肾间质转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGF β1)的表达，并初步探讨其可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及主要试剂

　　27只体重200～250 g清洁级雄性成年SD大鼠(由贵阳医学院动物中心提供);盐酸消旋山莨菪碱注射液(批号0712202，天津金耀氨基酸有限公司，规格10 mg∶1 ml);兔抗大鼠TGFβ1(浓缩型，编号BA0290，武汉博士德生物工程有限公司);兔SP检测试剂盒(即用型，包括：封闭用正常山羊血清工作液、生物素标记羊抗兔IgG和辣根酶标记链酶卵白素工作液，编号SP9001，北京中杉金桥生物技术有限公司);DAB显色剂(即用型，编号ZLI9032，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2 动物分组

　　将27只大鼠随机分为3组，每组9只：假手术组(SHAM组，S组，分离输尿管而不结扎)、模型组(UUO组，U组，结扎左侧输尿管)、山莨菪碱治疗组(anisodamine组，A组，结扎左侧输尿管)。于术后第1天开始，A组按14 mg·kg-1·d-1予腹腔注射山莨菪碱注射液[2];S组及U组以等量生理盐水予腹腔注射。术后第11天处死各组大鼠。各组分别取左侧肾脏组织标本，随即用10%福尔马林固定2 d后脱水、石蜡包埋并切片。

　　1.3 制模及标本收集

　　单侧输尿管结扎术(unilateral ureteral obstruction,UUO)致肾小管间质纤维化模型。手术方法如下：10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，待麻醉生效后将大鼠固定，取左侧腹部为手术切口，去毛备皮，打开腹腔暴露左侧输尿管，在近肾端结扎2处，2结扎点中间剪断输尿管后关闭腹腔。假手术组打开腹腔后游离左侧输尿管，不结扎剪断输尿管即关闭腹腔。术后如前述予药物治疗10 d，第11天处死各组大鼠。各组分别取左侧肾脏组织标本，随即用10%福尔马林固定2 d后脱水、石蜡包埋并切片。

　　1.4 肾组织病理学检查

　　切片经HE染色后，在显微镜200倍下单盲依序分别在左上、左下、右上、右下、中间各取2个视野，每张切片共10个视野，依据肾间质纤维化、肾小管萎缩、肾间质细胞浸润、红细胞管型、蛋白管型、肾间质水肿、肾小管扩张、肾小管细胞空泡变性等8项指标来观察肾间质病理改变，并作肾小管间质损伤指数(tubulointerstitial damage index,TDI)评分。切片经Masson染色后，在显微镜200倍下单盲依序每张切片随机采集5个不重复视野(左上、左下、右上、右下、中间)，蓝色为纤维化阳性染色区，观察肾间质纤维化程度并作半定量分析。分别测量每个视野中肾小管间质纤维化阳性染色的相对面积，取平均值。肾小管间质纤维化相对面积=肾小管间质纤维化阳性(蓝色)面积/整个视野面积[3,4]。肾间质纤维化指数(tubulointerstitial fibrosis index,TFI)评判标准:无着色0分;轻度(阳性面积<25%)1分;中度(阳性面积25%～50%)2分;重度(阳性面积>50%)3分。

　　1.5 免疫组织化学检测

　　1.5.1 SP免疫组织化学法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法) 石蜡切片脱蜡至蒸馏水后，3%过氧化氢甲醇以消除内源性过氧化物酶的活性。以高压加热方法抗原修复。山羊血清封闭后每张切片滴加50 μl一抗，37 ℃温水箱孵育60 min。此后每张切片依次滴加剂量为50 μl的二抗和三抗(辣根酶标记链霉卵白素工作液)，并分别于37 ℃温水箱孵育30 min。DAB显色。以不加一抗的切片为阴性对照，已知大鼠肾组织纤维化细胞胞浆染上棕褐色为阳性表达，并以此染色标本切片为阳性对照。

　　1.5.2 结果判定及半定量分析 TGFβ1蛋白的阳性表达为组织染上棕褐色，主要位于肾小管及肾间质。采用计算机Imagepro多媒体彩色病理图像分析软件对该指标进行免疫组织化学半定量分析。方法如下：在显微镜200倍中分别取15个不重复的肾小管间质视野，按阳性组织所占视野百分比进行半定量评分后取均值。每张切片评分标准：无着色0分;轻度(阳性面积<25%)1分;中度(阳性面积25%～50%)2分;重度(阳性面积>50%)3分。

　　1.6 统计学分析

　　应用SPSS11.5 for windows软件包对数据进行统计学分析处理，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA);各项指标之间作Pearson相关分析。以上均以P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肾组织形态学

　　2.1.1 肉眼观察 S组肾脏大小形态正常，颜色暗红;U组及A组梗阻侧肾脏均明显肿大，颜色变浅，有囊性感，内含褐色混浊液体，肾实质变薄。

　　2.1.2 HE染色 S组偶见肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTEC)空泡变性，灶状单核细胞浸润;U组可见弥漫的RTEC空泡变性，肾间质大量单核细胞浸润及纤维化，多数肾小管扩张、萎缩，部分缺血性梗死和灶状出血。A组上述改变均较U组有不同程度的减轻。A组肾间质损伤指数(TDI)较U组降低(P<0.05)，但仍高于S组(P<0.05)，见表1、图1。

　　2.1.3 Masson染色 S组肾间质无明显蓝染纤维化病变;U组肾间质可见大量蓝染的纤维化病变，多数肾小管萎缩;A组上述改变均较U组有不同程度减轻，肾间质纤维化指数(TFI)均较U组降低(P<0.05)，但仍高于S组(P<0.05)，见表1、图2。

　　2.2 免疫组织化学染色 TGFβ1的表达 S组仅肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTEC)有微弱TGFβ1表达;U组及A组均出现RTEC和肾间质细胞大量表达TGFβ1;但A组TGFβ1的表达与U组相比较则有所降低(P<0.01)。见表1、图3。半定量分析比较 U组TGFβ1的表达较S组明显上调(P<0.01),A组TGFβ1的表达较U组明显下调(P<0.05)。相关性分析:TGFβ1与TDI(r=0.0.739，P<0.05)、TFI(r=0.719，P<0.05)呈正相关。表1 各组大鼠TDI、TFI及TGFβ1水平注：组间比较顺序为模型组与假手术组，治疗组与模型组;(1)P<0.01,(2)P<0.05;n=9注：模型组损伤程度重，治疗组损伤程度轻

　　3 讨论

　　RIF是各种原因所致慢性肾脏疾病进行性发展的共同途径和主要病理学基础，它可作为预测肾功能恶化的一个十分准确的指标[5]。本实验采用研究肾间质病变较好的大鼠UUO模型(U组)，探寻RIF的临床防治新方法。

　　是启动和终止肾脏纤维化的关键细胞因子之一[6]。生理状态下，TGFβ1在RTEC微弱表达;病理状态下，活化的肾间质细胞和MyoF大量分泌TGFβ1。TGFβ1以自分泌、旁分泌及内分泌方式与细胞表面受体结合，通过细胞内信号转导途径来调控肾间质细胞的增殖、分化与凋亡，使肾间质TGFβ1持续上调表达，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成增多及代谢失衡，从而参与肾间质纤维化[7，8]。本实验结果也证实，S组RTEC微弱表达TGFβ1，U组TGFβ1在RTEC和肾间质细胞大量表达，且该两组之间差异具有统计学意义(P<0.01);而A组TGFβ1表达明显下调，与U组相比差异具有显著性(P<0.01)。相关性分析显示，肾组织TGFβ1的表达量与TDI(r=0.0739，P<0.05)、TFI(r=0.719，P<0.05)均呈正相关，说明TGFβ1的增多与肾组织纤维化存在因果关系，它的上调与下降可反映纤维化生成与降解的过程，反映肾纤维化的程度，与文献报道一致[6,8]。

　　Ani属于M受体阻滞剂，具有与阿托品相似的抗胆碱作用及解除微血管痉挛、改善微循环及镇痛等作用，且其副作用较小毒性较低。目前已知临床应用于肝硬化腹水、有机磷农药中毒、格林-巴利综合征、肾小球肾炎、特发性血小板减少性紫癜等80余种疾病的治疗，且大多疗效良好。罗琳等[1]研究发现，Ani可改善肝纤维化和肝硬化症状。其可能机制为，通过抑制肝脏细胞表达TGFβ1及其受体TβR I，减弱TGFβ1的生物学活性，从而减轻ECM沉积和肝内血管纤维化[2]。但Ani在RIF防治方面的探讨，目前尚无相关报道。本次实验结果显示，与U组比较，A组的TDI、TFI及TGFβ1表达均有所下降(P<0.05)，说明Ani对肾脏纤维化具有一定的保护作用。Ani可通过阻滞M受体作用从而改善肾脏微循环，同时还具有可使肾小管间质损伤、肾间质纤维化病变减轻，以及下调TGFβ1的表达等治疗作用。考虑其机制可能与抑制成纤维细胞增殖和表型转化、一定程度上减轻肾小管间质损伤以及下调肾间质细胞TGFβ1表达等有关，在延缓RIF治疗上有望成为RIF防治的药物之一。

　　【参考文献】

　　[1]罗琳，周爱玲，徐济良.山莨菪碱对肝纤维化门静脉压力影响及其机制[J].中国药理学通报，2005(9):1136-1137.

　　[2]王蓬波，罗琳，张洪，等.山莨菪碱对肝纤维化大鼠转化生长因子β1及受体表达的影响[J].南通大学学报·医学版，2006(3):172-174.

　　[3]Wu M J,Wen M C,Chiu Y T,et al.Rapamycin attenuates unilateral ureteral obstructioninduced renal fibrosis[J].Kidney Int,2006(11):2029-2036.

　　[4]Kristy L,Edgtton J,Renae M,et al.Plasmin is not protective in experimental renal interstitial fibrosis[J].Kidney Int,2004(2):68-76.

　　[5]何玉华，冯梅，梁勇，等. 肾小管上皮细胞表型转化在肾小管间质纤维化中的作用 [J]. 中国中西医结合肾病杂志，2005(6): 308-311.

　　[6]薛瑞，卢玲，张宝鉴. 肾纤维化诊断研究进展[J].山西中医学院学报，2006(6):58-59.

　　[7]Hayashida T,Decaestecker M,Schnaper HW.Crosstalk between ERK MAP kinase and Smad signaling pathway enhances TGFbetadependent responses in human mesagnial cell[J].FASEB J,2003(11):1576-1578.

　　[8]Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics[J].Kidney Int,2006(2):213-217.