高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究

　　作者：陆卫平　　作者单位：南京医科大学附属淮安第一医院 内分泌科,江苏 淮安 223300;

　　【摘要】目的 观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响,同时观察膦甲酸钠对高磷诱导该细胞钙化的干预作用。方法 体外培养牛主动脉平滑肌细胞，观察不同磷浓度(Pi 1.5、2.0mmol•L-1)、不同培养时间(3、6、9d)血管平滑肌细胞的钙沉积，以及不同磷浓度(Pi 1.5、2.0、2.5mmol•L-1)培养血管平滑肌细胞72h骨钙素的表达。同时观察不同浓度膦甲酸钠对高磷(Pi 2.0mmol•L-1)诱导的钙沉积和骨钙素增加的抑制作用。用甲O酚酞络合酮方法测定钙含量;放射免疫法测定培养上清液中骨钙素的浓度;BCA法测定蛋白含量，用蛋白含量标化钙含量与骨钙素浓度;RTPCR测定骨钙素mRNA的表达。结果 在相当于正常血磷浓度(1.5mmol•L-1)的培养基中，平滑肌细胞钙沉积量小;而在相当于高磷血症(2.0mmol•L-1)的培养基中，钙沉积明显增加[培养6d，(77.187±11.692)vs(25.768±1.750)μg•(mg蛋白)-1，P<0.01],并呈时间和剂量依赖性。与Pi 1.5mmol•L-1组相比，Pi 2.0 mmol•L-1组培养上清液中骨钙素的水平明显增高[(1.503×10-2±2.601×10-3)vs(2.981×10-3±8.382×10-4)ng•(μg蛋白)-1，P<0.001];Pi 2.0mmol•L-1组平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达也明显增加(OC/GAPDH，1.906±0.132 vs 0.748±0.0366，P<0.001)。膦甲酸钠能有效地抑制钙沉积[培养6d，Pi 2.0mmol•L-1+PFA 1.0mmol•L-1组vs Pi 2.0mmol•L-1组，(37.729±5.899)vs(77.187±11.692)μg•(mg蛋白)-1，P<0.001]和上清液中骨钙素的表达[(4.529×10-3±1.250×10-3)vs(1.503×10-2±2.601×10-3)ng•(μg蛋白)-1，P<0.001]及平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达(OC/GAPDH，0.642±0.092 vs 1.885±0.165，P<0.01)。结论 高磷能直接促进血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加，说明高磷血症可能是促进血管钙化的独立危险因素;膦甲酸钠能有效地抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加，可以作为 一种新的防治高磷诱导血管钙化的药物。

　　【关键词】 血管平滑肌细胞,磷酸盐,钙化 骨钙素 膦甲酸钠

　　Abstract:Objective To evaluate the effects of different concentrations of phosphate on calcium deposition and osteocalcin level in bovine aortic smooth muscle cell cultures and observe the effects of phosphonoformic acid(PFA)in different concentrations on vascular calcification induced by elevated phosphate.MethodsBovine aortic smooth muscle cells(BASMC)were cultured.Calcium deposition and the expression of osteocalcin in different concentrations of phosphate(1.5 and 2.0mmol•L-1)and PFA were determined by ocresolphthalein complexone and radioimmunity methods respectively，osteocalcin mRNA expression were determined by RTPCR.Results After six days of BASMC culture,the calcium deposition in Pi 2.0mmol•L-1 group was more than that in Pi 1.5mmol•L-1 group[(77.187±11.692)vs(25.768±1.750)μg•(mg protein)-1,P<0.01].The calcium deposition was dependent on time and dosage of phosphate treatment.After 72h culture，the osteocalcin in Pi 2.0mmol•L-1 group was more than that in Pi 1.5mmol•L-1 group [(1.503×10-2±2.601×10-3)vs(2.981×10-3±8.382×10-4)ng•(μg protein)-1,P<0.001),the same as osteocalcin mRNA expression(OC/GAPDH,1.906±0.132 vs 0.748±0.0366，P<0.001).PFA decreased ciacium deposition[Pi 2.0mmol•L-1+PFA1.0mmol•L-1 group vs Pi 2.0mmol•L-1 group,(37.729±5.899)vs(77.187±11.692)μg•(mg protein)-1，P<0.001]and osteocalcin expression[(4.529×10-3±1.250×10-3)vs(1.503×10-2±2.601×10-3)ng•(μg protein)-1,P<0.001]statistically,as well as osteocalcin mRNA expression(OC/GAPDH,0.642±0.092 vs 1.885±0.165，P<0.01).Conclusion Hyperphosphate may directly promote calcium deposition and the osteocalcin expression of BASMCs,it may be a new explanation of the phenomenon on vascular calcification under hyperphosphatemic conditions.Hyperphosphatemia is an independent factor to stimulate vascular calcification.PFA can inhibit calcium deposition and osteocalcin expression induced by elevated phosphate.PFA may be a new medicine to treat vascular calcification induced by elevated phosphate.

　　Key words:vascular smooth muscle cell;phosphate;calcification;osteocalcin;phosphonoformic acid

　　终末期肾病(ESRD)接受长期肾替代治疗的患者越来越多，这些患者的一个严重问题是血管病变，包括缺血性心脏病、脑血管病变和动脉粥样硬化，是其主要的死因。ESRD患者(即使是年轻的患者)常存在血管钙化，与病死率呈正相关[1]。肾病特别是ESRD患者常存在高磷血症。近来高磷血症被认为是引起血管钙化和心血管病变死亡的主要危险因素之一[2]。Kestenbaum等[3]研究发现，高磷血症是导致ESRD患者病死率和心肌梗死发生率升高的危险因素，且独立于肾功能和其他已知危险因素。研究高磷血症致血管钙化的机制及防治措施具有重要的临床意义。本实验观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素表达的影响，初步探讨高磷血症促进血管钙化的可能机制;同时观察膦甲酸钠(phosphonoformic acid，PFA)对高磷诱导该细胞钙化的干预作用，从而为防治ESRD患者血管钙化提供新的理论观点。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器和试剂

　　健康新生小牛胸主动脉由南京血清厂提供，胎牛血清为上海浦东开发区高桥兽医站产品，DMEM、胰蛋白酶为Gibco公司产品，钙测定试剂盒为Sigma公司产品，BCA蛋白测定试剂为上海吉泰生物技术公司产品，骨钙素放射免疫分析试剂盒购自天津市协和医药科技有限公司，RTPCR试剂盒为大连宝生物有限公司产品，膦甲酸钠由江苏天晴制药厂提供。细胞培养箱(Queue公司产品， Q2711型)，YJ875医用净化工作台(苏州净化设备厂)，倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂，XSZD型)，高速、低温离心机(Heeraeus,D37520型)，PCR仪(GeneAmp PCRsystem 9600)，电泳仪(LKB BROMMOL/LA 2197 power supply)，UVP凝胶密度扫描仪(美国 Gene公司)。

　　1.2 牛主动脉平滑肌细胞(VSMC)的培养

　　采用贴壁法原代培养。无菌条件下迅速取出健康新生小牛胸主动脉，置于无菌培养皿中，用DHanks液洗净，剥离血管外结缔组织;以眼科剪纵行剖开，小心剥离血管外膜和内膜，然后用眼科剪将血管中膜剪成1mm3大小，接种于100ml培养瓶中，置37℃、体积分数为5%CO2孵箱中培养3～4h，待其贴壁后加入含有15%胎牛血清、100U•ml-1青霉素、100μg•ml-1链霉素的DMEM培养液约4ml，静置于37℃、体积分数为5%CO2孵箱中继续培养。每周换液2次。一般在接种后7～10d可见平滑肌细胞由组织边缘爬出，光镜下细胞呈贴壁极性生长，高低起伏呈“峰”、“谷”状。待VSMC生长融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化、传代培养。

　　5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板，细胞融合后换用正常磷(Pi 1.5mmol•L-1)、高磷(2.0mmol•L-1)培养基培养10d,2组培养基中钙离子浓度为1.8mmol•L-1。同时用Pi1.5mmol•L-1、Pi2.0mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0.25、0.5、1.0mmol•L-1)培养基培养3d,所有培养基中钙离子浓度均为1.8mmol•L-1。换用培养基的第1天定为0天。

　　1.3 钙沉积定量

　　培养不同天数的细胞用DHanks液洗涤3次后，0.6mol•L-1盐酸脱钙24h。盐酸悬液中钙含量用甲O酚酞络合酮方法测定。脱钙后的细胞用DHanks液洗涤3次，0.1mol•L-1NaOH/0.1%SDS溶解细胞，BCA(Bicinchoninic acid)法测定蛋白含量。用蛋白含量标化钙含量。

　　1.4 骨钙素测定及RTPCR

　　第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于6孔培养板及培养瓶，细胞汇合后换用不同磷浓度的培养基:Pi 1.5、Pi2.0、Pi2.5mmol•L-1及Pi2.0mmol•L-1+PFA(浓度分别为0.25、0.5、1.0mmol•L-1)培养基培养72h。125I放射免疫法测定上清液骨钙素浓度，用蛋白含量标化骨钙素浓度。

　　RTPCR法测定骨钙素mRNA的表达：第5～6代细胞胰蛋白酶消化后分别接种于培养瓶，培养72h，磷及PFA浓度同上。根据GenBank数据库bovine osteocalcin mRNA序列，利用Primer Premier引物设计与分析软件设计骨钙素引物,引物序列为：骨钙素上游5′GGCGCTACCTGGACCACTG3′，下游5′GCCGTAGA AGCGCCGATAG3′(146bp);内参照GAPDH上游 5′TTCCGCGTCCCCACTCCCAAC3′,下游5′GTGGCGG AGATGGGGCAGGACT3′(398bp)。引物委托上海生工生物技术有限公司合成。Trizol法提取总RNA，在20μl反应体系中进行逆转录反应，反应产物用于PCR扩增。变性 94℃，45s;退火55℃，45s;延伸 72℃，90s;循环35次。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察，用凝胶扫描系统进行光密度积分扫描，以GAPDH为内标，计算OC/GAPDH光密度积分比值进行定量分析。

　　1.5 统计学处理

　　数据以x-±s表示，用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，多组均数的比较采用方差分析，两组均数的比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 平滑肌细胞的鉴定

　　在载玻片上培养的平滑肌细胞生长融合后，用免疫组化法(αactin、角蛋白)证实为血管平滑肌细胞。

　　2.2 不同磷浓度培养不同时间对平滑肌细胞钙沉积的影响

　　见表1。表1不同磷浓度培养不同时间对平滑肌细胞钙沉积的影响(略)

　　由表1可见，随着培养时间的延长，Pi 2.0mmol•L-1组平滑肌细胞钙沉积比Pi 1.5mmol•L-1组明显增加(P<0.01)，且呈时间和剂量依赖性。

　　2.3 PFA对钙沉积的干预作用

　　见表2。 表2 PFA对钙沉积的干预作用(略)

　　由表2可见，随着磷浓度的增高，钙沉积明显增加(P<0.001);PFA能有效地减少钙的沉积(P<0.001)，且呈剂量依赖性。

　　2.3 培养上清液骨钙素浓度的测定

　　见表3。 表3培养上清液中骨钙素水平(略)

　　由表3可见，Pi 2.0mmol•L-1组、Pi 2.5mmol•L-1组与Pi 1.5mmol•L-1组相比，培养上清液中骨钙素浓度增加，差异有统计学意义(P<0.001);PFA能有效地降低骨钙素的浓度(P<0.05或P<0.001),且呈剂量依赖性。

　　2.4 骨钙素mRNA的表达

　　见图1、2，表4。表4平滑肌细胞中骨钙素mRNA的表达(略)

　　由表4可见，高磷促进血管平滑肌细胞骨钙素mRNA的表达(P<0.001)，而PFA能抑制骨钙素mRNA的表达(P<0.01)，且呈剂量依赖性。

　　3讨论

　　磷对于维持正常的多种生理功能非常重要，包括细胞信号传导、矿物质代谢和能量交换等。血浆中磷主要以无机磷盐的形式存在，通过饮食吸收、骨形成、肾脏排泄和细胞内储存等维持在正常生理范围[4]。随着肾功能减退，磷储留致高磷血症，甲状旁腺激素(PTH)水平增高，1,25(OH)2D3水平下降。慢性肾功能衰竭患者高磷血症与高PTH相关。长期透析的患者，PTH水平的升高与左心室肥大、心血管病及死亡高度相关[3]。血管钙化加重动脉粥样硬化斑块病变，加之左心室肥大、冠脉灌注减少，使心肌梗死发生率和斑块的不稳定性增加;大血管中层钙化使得血管的硬度增加，动脉脉速和脉压差增加，顺应性降低。因此，血管钙化增加了心血管疾病的发生率和死亡率[2]。本实验模拟人体内转移性血管钙化的许多特征，体外研究磷在血管平滑肌细胞钙化中的作用。发现与相当于正常血磷培养基中生长的平滑肌细胞相比，在高磷培养基中生长的平滑肌细胞钙沉积明显增加(P<0.01);且随着时间的延长，钙沉积继续增加。表明高磷可导致培养的牛血管平滑肌细胞钙化，磷以时间和剂量依赖性方式诱导平滑肌细胞钙化。

　　越来越多的证据表明，血管钙化是一个由多种不同的机制触发的主动调节过程[5]，包括：(1)缺乏钙化的抑制因素;(2)诱导骨形成;(3)细胞死亡;(4)循环中的晶核复合物(如骨重塑时释放的磷酸盐和蛋白质可导致异位钙化)。每一种机制都可引起矿物质代谢异常，钙磷乘积增高，进一步加重了血管钙化。最近研究发现，钙化的动脉粥样硬化病变表达骨基质蛋白，如骨桥素、基质Gla蛋白和骨钙素。这表明血管钙化是一种类似于骨形成的主动调节过程，骨相关蛋白参与了钙化过程[6]。

　　骨钙素是由成骨细胞和成牙本质细胞特异合成和分泌的一种非胶原蛋白，是构成骨基质的成分之一。绝大部分骨钙素是由成骨细胞、类似成骨细胞的钙化血管细胞分泌的，而正常血管平滑肌细胞分泌量极少。骨钙素的出现，表明表达成骨细胞表现型的细胞在血管钙化的发生过程中起中心作用。现认为骨钙素是成骨细胞最终分化的特异性指标，是反映机体骨代谢变化的灵敏、可靠的标识之一[7]。骨钙素含有3个Gla残基，与羟磷灰石有很高的结合力，所以一旦发生钙沉积，就会结合于沉积的羟磷灰石。本实验证实，高磷可直接促进平滑肌细胞骨钙素表达的增加。Jono等[8]推测，细胞外高磷或细胞钠依赖的磷共同转运体(NPC)水平增高，通过Pit1(Ⅲ型NPC)的作用使细胞内磷的水平升高。这就触发了促进细胞内钙化过程的机制。高磷使易于钙化的细胞外基质增加。高磷刺激平滑肌细胞核心结合因子(Cbfa1)及其下游转录靶基因骨钙素的表达。Cbfa1是成骨细胞分化、骨基质基因表达和骨矿化所必需的成骨细胞特异性转录因子。

　　控制高磷血症是临床肾脏病工作者所面临的主要难题之一，防止肾衰竭患者出现高磷血症及钙磷乘积的升高，不仅可以延缓继发性甲状旁腺亢进的进展，而且可以降低心血管病变的发生率和死亡率[9]。本实验发现，PFA能有效地抑制血管平滑肌细胞的钙沉积及骨钙素的表达。PFA是一种抗病毒药，可能通过抑制细胞膜NPC的活性，降低细胞内磷的浓度，减少Cbfa1及其下游转录靶基因骨钙素的表达，从而抑制血管平滑肌细胞的钙化[10]。PFA的这些特点，以及低毒性，可以作为一种新的防治高磷血症相关性病变的治疗措施，但有待于进一步的研究。

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