内分泌科雌二醇对骨髓基质细胞分化的作用

　　内分泌科雌二醇对骨髓基质细胞分化的作用

　　作者：袁成良 薛萍 黄海 邹自英 金小岚

　　【关键词】 内分泌

　　摘要 目的研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中，17β雌二醇(E2)对其骨形态发生蛋白受体ⅠB(BMPRⅠB)及过氧化物酶增殖活化受体γ2(PPARγ2)mRNA表达的影响，探讨雌二醇对骨髓基质细胞分化的作用。方法 1，25(OH)2D3和地塞米松(DEX)诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化，应用半定量RTPCR及Northern　blot技术，观察不同浓度E2对骨髓基质细胞分化过程中BMPRⅠB及PPARγ2mRNA表达的影响;以α磷酸奈酚为底物，测定细胞碱性磷酸酶的活性，Van　Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量。结果 E2能明显增强骨髓基质细胞分化过程中BMPRⅠB　mRNA的表达，E2浓度为(0～10-6)mol/L时，BMPRⅠB　mRNA的表达随E2浓度增加而增加，从(2.0±0.4)%增至(4.8±1.0)%(P<0.05)和(17.3±2.2)%(P<0.01);E2能明显促进骨髓基质细胞在分化介质中PPARγ2　mRNA的表达，在上述E2浓度时，PPARγ2　mRNA的表达从(1.80±0.3)%增至(9.5±2.1)%(P<0.01)和(19.2±3.0)%(P<0.01);Northern　blot结果显示随着E2浓度的增加，BMPRⅠB　mRNA的表达从1.72±0.11增至3.73±0.31(P<0.01);PPARγ2　mRNA的表达量从1.47±0.12增至2.81±0.22(P<0.01)和4.02±0.36(P<0.01)。细胞ALP活性明显受E2的抑制，在上述E2浓度时ALP的活性从(42.6±2.5)降至(3.6±0.7)U/g蛋白(P<0.01)。Ⅰ型胶原含量均随E2浓度增加而降低。结论E2抑制体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞分化而促进其向脂肪细胞分化。

　　关键词 雌二醇;骨髓基质细胞;过氧化物酶增殖活化受体γ2;分化;骨形态发生蛋白受体ⅠB

　　The　Role　of　17βestradiol　(E2)　in　Differentiation　of　Bone　Marrow　Stromal　Cell

　　YUAN　Chengliang，XUE　Ping，HUANG　Hai，ZOU　Ziying，JIN　Xiaolan，Chengdu　Military　General　Hospital，Chengdu　610083

　　ABSTRACT Objective To　investigate　the　effects　of　17βestradiol(E2)　on　the　gene　expression　of　bone　morphogenetic　protein　receptor　ⅠB　(BMPRⅠB)　and　peroxisome　proliferatoractivated　receptor　gamma　2(PPARγ)　in　rat　bone　marrow　stromal　cells　exposured　to　the　differentiation　medium　and　to　elucidate　the　role　of　E2　on　differentiation　of　these　cells.Methods Adherent　bone　marrow　stromal　cells　from　3monthold　female　SD　rat　were　cultured　in　DMEM　supplemented　with　10%　FBS　and　dexamethasome　(DEX)　10-7　mol/L　and　1，25(OH)2D3　10-9　mol/L　and　different　concentrations　(0～10-6mol/L)　of　E2.Total　cellular　RNA　was　isolated　using　the　total　RNA　kit.The　effects　of　E2　on　BMPRⅠB　and　PPARγ2　gene　expression　were　assayed　by　semiquantitative　RTPCR　and　demonstrated　by　Northern　blot，respectively.Results E2　strongly　raised　the　expression　of　BMPRⅠB　mRNA　in　bone　marrow　stromal　cell.The　increase　was　dose　dependent.When　examined　under　various　concentrations　of　E2　(0～10-6mol/L)，the　expression　of　BMPRⅠB　mRNA　were　increased　from　2.0%±0.4%　to　4.8%±1.0%　(P<0.05)，8.0%±1.4%(P<0.01)　and　17.3%±2.2%(P<0.01).E2　strongly　stimulated　the　expression　of　PPARγ2　mRNA　in　bone　marrow　stromal　cell　from　(1.80±0.3)%　to　(9.5±2.1)%　(P<0.01)　and　(19.3±3.0)%　(P<0.01).Northern　blot　showed　that　the　expression　of　BMPRⅠB　and　PPARγ2　mRNA　in　bone　marrow　stromal　cell　was　increased　by　E2　from　1.72±0.11　to　3.73±0.31(P<0.01)　and　from　1.47±0.12　to　4.02±0.36(P<0.01)，respectively.The　activities　of　ALP　suppressed　from　(42.6±2.5　to　3.6±0.7)U/g　protein　(P<0.01)　by　E2.The　amount　of　type　Ⅰ　collagen　were　decreased　significantly　at　higher　concentrations　of　E2.Conclusions E2　promoted　bone　marrow　stromal　cells　differentiating　into　adipocytes　and　inhibited　osteoblastogenesis　in　vitro.

　　KEYWORDS 17βestradiol bone　marrow　stromal　cell peroxisome　proliferatoractivated　receptor　(PPARγ2) differentiation bne　morphogenetic　protein　receptor　ⅠB(BMPRⅠB)

　　骨形态发生蛋白受体(bone　morhogenetic　protein　receptor)有两个亚型，即BMPR1A、1B属丝氨酸苏氨酸激酶受体，它们与其配体结合，通过TGFβ超家族信号传递分子(signaltransducing　molecules　of　the　TGFβ　surperfamily，Smads)传递分化信号，调节骨髓基质细胞向成骨细胞(osteoblast，OB)或脂肪细胞分化[1～3]。过氧化物酶增殖活化受体γ2(peroxisome　proliferatoractivated　receptors　γ2，PPARγ2)是脂肪细胞分化的重要转录因子[4]，BMPR和PPARγ2与骨代谢密切相关。绝经后骨质疏松的病理生理机制尚未完全阐明，BMPR在其中的作用也不清楚，许多研究表明雌激素缺乏可导致成骨细胞生成增多，继而诱导破骨细胞生成并增强其功能。雌二醇(estradiol，E2)影响成骨细胞生成的分子机理尚不完全明了，尤其对BMPR与PPARγ2的作用知之甚少。本实验探讨E2对大鼠骨髓基质细胞在向成骨细胞分化过程中BMPRⅠB与PPARγ2　mRNA表达的影响，揭示E2对成骨细胞生成的作用，试图阐明绝经后高转换骨代谢的可能机制。

　　1材料与方法

　　1.1 骨髓基质细胞的分离培养

　　3月龄雌性SD大鼠约(200±20)克购于成都中医药大学实验动物研究中心。二氧化碳窒息大鼠，于75%乙醇中消毒，无菌条件下分离大鼠股骨，去除软组织，切除骨骺端，用5ml　DMEM培养液(购自Hyclone)冲出骨髓，悬浮细胞，1000r/min离心10min，弃上清，用DMEM洗涤2次，用含10%胎牛血清(购自Hyclone)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM　3ml制成细胞悬液，血细胞计数板计数，以每瓶107　cells接种于25ml培养瓶。37℃，5%CO2，静置培养，第3天换液，弃悬浮细胞，第10天以0.25%胰蛋白酶消化传代，接种密度每瓶105　cells，第3～4天融合后传代。

　　1.2 骨髓基质细胞的诱导分化[5]

　　在生长培养基中传代的大鼠骨髓基质细胞，用1，25(OH)2D3　10-9mol/L，地塞米松(dexamethasome，DEX)10-7mol/L诱导其向成骨细胞分化。根据E2的不同浓度分为4组，分别为0，10-10mol/L，10-8mol/L和10-6mol/L。3天后进行下面的实验，每项实验重复4次。(1，25(OH)2D3、DEX和E2购自Sigma)

　　1.3ALP活性测定

　　培养细胞用PBS冲洗2次，TrisTriton　X100(50mmol/L　Tris，2mmol/L　MgCl2，150mmol/L　NaCl，1%Triton　X100)缓冲液加超声粉碎裂解细胞，裂解产物离心后取上清液，以α磷酸奈酚为底物，在Beckman　CX7生化分析仪上测定碱性磷酸酶的活性，钨酸比浊法测定裂解液蛋白含量，以校正因细胞数不同引起的ALP活性差异。

　　1.4 Van　Gieson染色

　　10%中性甲醛固定培养于24孔板的骨髓基质细胞，蒸馏水冲洗，Weigert苏木素染液染色10min，自来水冲洗，0.5%盐酸乙醇分化，Van　Gieson染色，95%乙醇分化脱水，二甲苯透明，显微镜下观察并照相。

　　1.5引物设计

　　在大鼠PPARγ2基因cDNA上10375处设计引物，扩增后产物长度为366bp。上游引物：5′ACTCGGGAGATTCTCCTATT3′，下游引物：5′CTTATTGTAGAGCTGAG　TCTTCTC3′。BMPRⅠB扩增mRNA后产物长度为457bp，其引物为：5′CATTCCTCATCAAAGAAGTA3′，5′AGTGTTCTTCACCA　CA　GAG3′。用肌动蛋白(βactin)基因cDNA　313bp作内对照，上游引物：5′GACTACCTCATG　AAGATCCT3′，下游引物：5′GCGGATGTCCACG　TCACACT3′。引物用Jellyfish软件设计，由大连宝生物技术有限公司合成。

　　1.6 RTPCR

　　采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法提取RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260/A280均在1.8～2.0之间。RTPCR试剂盒和RNA提取试剂盒均由大连宝生物提供。采用一步法使逆转录反应与cDNA扩增在同一反应管中进行。50℃　30min进行逆转录反应，然后94℃变性2min，进入扩增。扩增条件为：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸80s，35个循环后72℃延伸反应增加7min。βactin循环数为25，其余参数同上。取扩增产物10μl与溴酚蓝上样缓冲液2μl混和后行1%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并成像。扩增后βactin　cDNA长313bp，PPARγ2　cDNA长366bp，BMPRⅠB扩增mRNA后产物长度为457bp。凝胶成像分析系统(UVI　photo　MV)分析图像，各表达量用扩增产物条带的光密度值与βactin条带光密度值之比值表示。

　　1.7Northern　blot

　　mRNA的甲醛变性胶电泳：在一微量离心管中加入RNA　4.5μl，5×甲醛胶电泳缓冲液2.0μl，37%甲醛3.5μl，甲酰胺10.0μl，置65℃保温15min，然后迅速置冰浴中，稍离心，加入2.0μl载样缓冲液，上样前凝胶预电泳5min，上样，恒压4V/cm电泳2小时。电泳结束后将凝胶中的mRNA经电转印至尼龙膜上。预杂交和杂交：将等量直接杂交缓冲液1和2混合，并预热至55℃，将混合液加入装有尼龙膜的塑料袋中，55℃杂交15min，预杂交后将尼龙膜放入另一塑料袋中，加入含HRP标记的探针(8ng/ml)，封口，于55℃杂交1.5h。洗涤：杂交结束后，将尼龙膜转入清洗液(2×SSC/0.1%SDS)中于55℃清洗3×5min后，在室温下用2×SSC液清洗3×5min。底物反应：将等量增强化学发光试剂与过氧化物酶底物溶液混合，加于膜上，室温孵育5min，弃反应液，用保鲜膜将尼龙膜包好，置暗盒中，放上X光片，暴光1min，并进行常规显影、定影。用Cliniscan2图象分析系统测定各条带的相对光密度值(分别以在生长培养基中培养3天的骨髓基质细胞中BMPRⅠB和PPARγ2光密度值为相对值1)。

　　1.8统计学处理

　　用SPSS11.0统计软件进行方差分析，数据以±s表示。

　　2 结果

　　2.1 骨髓基质细胞体外培养的形态特点

　　骨髓基质细胞接种后4小时开始贴壁，24～72小时可见贴壁细胞明显增大且分裂增殖，细胞呈三角形，多角形或梭形。3天后首次换液，贴壁细胞体积增大，呈集落生长，10天左右融合成遍。多次传代的骨髓基质细胞呈有序的成纤维细胞样分布。

　　2.2ALP活性

　　传代的rMSCs在分化培养基中培养3天，不同浓度E2条件下细胞均能产生ALP，其活性随E2浓度增加而降低，E2浓度为(0，10-10，10-8和10-6)mol?L-1时，ALP活性分别为(42.6±2.5，17.9±2.0，10.8±1.5和3.6±0.7)U/g(protein)(P<0.01)。

　　2.3 Van　Gieson染色

　　传代的rMSCs在分化培养基中培养3天，用Van　Gieson染色细胞，随着E2浓度的增加，胞浆染色越淡，由鲜红、淡红到黄色。胞浆呈红色说明有胶原合成，红色越深，表明胶原越多。

　　2.4E2对BMPRⅠB和PPARγ2　mRNA表达的影响

　　在含1，25(OH)2D3和DEX的分化培养基中，E2能明显增加骨髓基质细胞BMPRⅠB　mRNA的表达，随E2浓度的增高，其表达量递增，这种作用有剂量依赖性(见表1)。E2能明显促进骨髓基质细胞PPARγ2　mRNA的表达，随E2浓度的增高，其表达量从(1.3±0.5)%增至(7.0±1.7)%(P<0.05)和(17.7±2.5)%(P<0.01)(见表1)。RTPCR的结果被Northern　blot所证实：BMPRⅠB　mRNA为1.59kb，PPARγ2　mRNA为1.43kb，在X光片上有相应kb的条带出现，表明RTPCR不存在假阳性，而且各条带的相对光密度值也随E2浓度的增加而增加(见表2)。表1E2对骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1及PPARγ2　mRNA表达的影响(略)注：与0浓度比较　P<0.05 　P<0.01表2 E2对骨髓基质细胞分化过程中Cbfα1和PPARγ2　mRNA表达的影响(略)注：与0浓度比较P<0.05 P<0.01

　　3 讨论

　　骨形态发生蛋白(BMP)是目前已知的唯一能诱导未定向干细胞向成骨细胞分化的局部调节因子，BMPs与BMPRs结合，通过TGFβ信号传递分子(Smads)传递分化信号，促进多能干细胞、骨髓基质细胞和前成骨细胞向成骨细胞(软骨细胞)或脂肪细胞分化，在此过程中细胞的分化方向可能取决于BMPs与何种受体亚型结合，BMPR亚型在BMP介导的细胞分化中发挥重要作用。

　　绝经后雌激素下降，成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(osteoclast，OC)生成增加，BMPR亚型对OB生成有无作用，E2变化是否影响BMPR亚型的表达，继而影响OB的生成，我们的结果显示随着E2浓度的增加，ALP活性降低，Ⅰ型胶原合成减少，且呈剂量依赖性，表明E2有抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化成熟的作用。在该培养体系中，E2促进BMPRⅠB　mRNA的表达，而骨髓基质细胞向成骨细胞分化降低，提示BMPRⅠB的表达不利于成骨细胞的分化成熟。然而对于不同的细胞系，BMPR不同亚型在成骨细胞和脂肪细胞分化中的作用也不完全一致。在2T3细胞中高表达突变的BMPRⅠB，抑制其向成骨细胞转化;在该细胞中再转染野生型BMPRⅠB，则促使其向OB分化。而在2T3细胞中高表达突变的BMPRⅠA，抑制其向脂肪细胞转化，再转染野生型BMPRⅠA，又促进其向脂肪细胞转化[6]，提示对于2T3细胞，BMPRⅠA是向脂肪细胞分化的主要受体，而BMPRⅠB则是向成骨细胞分化的主要受体。BMPRⅠA使C2C12细胞向OB转化，而BMPRⅠB则不能[7]。这些研究结果提示BMPs在细胞分化中的不同作用，一方面要取决于何种细胞系，另一方面要决定于BMP与何种受体亚型结合及其启动的信号传导途径，不同的传导途径与决定成骨细胞分化的转录因子和决定脂肪细胞分化的PPARγ2密切相关。

　　过氧化物酶增殖体活化受体(PPARs)是配体活化的转录因子，属核激素受体超家族。PPARγ2是脂肪细胞分化的特异性转录因子，一方面它能增加周期蛋白依赖的激酶抑制剂，阻断细胞生长，使之进入分化;另一方面它能与脂肪细胞特异基因ap2的增强子和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)启动子结合，调节这些基因的转录与表达[8～10]。研究表明BMPs通过不同受体亚型介导2T3细胞向成骨细胞或脂肪细胞分化;有PTH受体和高ALP活性的WesterBarnton细胞在胎儿形成期分化为成骨细胞，经化疗药物处理后转化为脂肪细胞[11];用有限稀释法从兔骨髓培养细胞中分离的前脂肪细胞具有成骨潜能[12];在成骨细胞培养系中加入脂肪酸，前成骨细胞转化为脂肪细胞[13]。这些研究结果提示决定成骨细胞分化的核结合因子α1(Cbfα1)和决定脂肪细胞分化的PPARγ2之间必然存在某种关联。

　　我们的结果显示E2能明显促进在分化培养期中的骨髓基质细胞PPARγ2　mRNA的表达，从而介导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化;E2降低骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中细胞ALP活性及Ⅰ型胶原的合成，表明E2抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化。E2可能通过调节PPARγ2　mRNA的表达而降低OB生成。近年研究表明，在骨髓基质细胞中高表达PPARγ2，刺激骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，而通过抑制Cbfα1　mRNA的表达，减少OB生成[14]。

　　综上所述，对于BMP与BMPR不同亚型结合，介导基质细胞向不同细胞系分化，E2通过对骨髓基质细胞BMPRⅠB、PPARγ2表达的调节，从而控制基质细胞向脂肪细胞分化。绝经妇女因雌激素缺乏，E2对骨髓基质细胞PPARγ2　mRNA表达的调节作用下降，使其向OB分化，继而破骨细胞增加，引起高转换骨代谢，可能是绝经后高转换骨代谢发生的机制之一。

　　参考文献

　　1 Asahin　I，Sampath　TK.Hauschka　PU.Human　osteogenic　protein1　induces　chondroblastic，osteoblastic，and/or　adipocytic　differentiation　of　clonal　murine　target　cells　[J].Exp　Cell　Res　1996，222(1)：38～47

　　2 Lecanda　F，Avioli　LV，Cheng　SL.Regulatation　of　bone　matrix　protein　expression　and　induction　of　differentiation　of　human　osteoblasts　and　human　bone　marrow　stromal　cells　by　bone　morphogenetic　protein2　[J].J　Cell　Biochem，1997，67(1)：386～396

　　3 Gori　F，Thomas　T，Hicok　KC，et　al.Differentiation　of　human　marrow　stromal　precursor　cells　by　bone　morphogenetic　protein2　increases　CBFA1/OSF2，enchance　osteoblast　commitment，and　inhibits　late　adipocyte　maturation　[J].J　bone　Miner　Res，1998，14(4)：1522～1535

　　4 LeckaCzernik　B，Gubrij　I，Moerman　E，et　al.Inhibition　of　Osf2/Cbfα1　expression　and　terminal　osteoblast　differentiation　by　PPAR　γ2　[J].J　Cell　Biochem　1999，74(3)：356～371

　　5 Francesca　Gori，Lorenz　C.Hofbauer.Colin　R.Dunstan　et　al.The　expression　of　osteoprotegerin　and　RANK　ligand　and　the　support　of　osteoclast　formation　by　stromalosteoblast　lineage　cell　is　developmentally　regulated　[J].Endocrinolgy.2000，141：4768～4776.

　　6 Chen　D，Ji　X，Harris　MA，et　al.Differential　roles　for　bone　morphogenetic　protein　(BMP)　receptor　type　ⅠB　and　ⅠA　in　differentiation　and　specification　of　mesenchymal　precusor　cells　to　osteoblast　and　adipocyte　lineages　[J].J　Cell　Biol　1998，142：295～305.

　　7 Katagiri　T，Yamaguchi　A，Ikeda　T.et　al.The　nonosteogenic　mouse　pluripotent　cell　line，C3H10T1/2，is　induced　to　differentiate　into　osteoblastic　cells　by　recombinant　human　bone　morphogenetic　protein2　[J].Biochem　Biophy　Res　Commun　1990，172：295～299.

　　8 Tontonoz　P，Hu　E，Spiegelman　BM.Stimulation　of　adipogenesis　in　fibroblasts　by　PPAR　γ2，a　lipidactivated　transcription　factor　[J].Cell　1994，79：1147～1156.

　　9 Takahashi　N，Kawada　T，Yamamoto　T，et　al.Overexpression　and　ribozymemediated　targeting　of　coactivators，CREB　binding　protein　(CBP)　and　p300，revealed　their　indispensable　roles　in　adipocyte　differentiation　through　the　regulation　of　peroxisome　proferatoractivated　receptoegamma　(PPARgamma)　[J].J　Biol　Chem　2002，277：15564～15570

　　10?Adelmant　G，Gilbert　JD，Freytag　SO.Human　translocation　liposarcomaCCAAT/enhancer　binding　protein　(C/EBP)　homologous　protein　(TLSCHOP)　oncoprotein　prevents　adipocyte　differentiation　by　directly　interfering　with　C/EBPβ　function　[J].J　Biol　Chem　1998，273：15574～15581