大鼠肺内降钙素基因相关肽和5

　　作者：樊平，刘晔，康林，张峰，刘力斗，崔慧先

　　(河北医科大学： 解剖学教研室， 第二医院外科，河北 石家庄 050017)

　　【摘要】 目的： 探讨大鼠肺内降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptiole, CGRP)和5羟色胺(5hydroxytryptamine, 5HT)免疫反应细胞的个体发生及分布，揭示肺神经内分泌细胞的功能及其内分泌机制的形态学基础. 方法： 应用免疫组织化学方法、激光扫描共聚焦技术及计算机图像分析. 结果： CGRP和5HT阳性细胞最早见于胚16 d肺组织中，随胎龄增大其数量增多且分布广泛，胚20 d达高峰，生后阳性细胞数量减少[神经内分泌(NE)/1×103上皮细胞(BE)：382±13 vs 94±17; 387±47 vs 88±18; P<0.01，以出生后1 mo为例]. 共聚焦显微镜结果也证实随胎龄增加，CGRP和5HT阳性细胞数量增加且细胞荧光强度增强，而生后强度减弱(P<0.01). 相邻切片法观察可见多数表达CGRP的阳性细胞也含有5HT免疫反应物. 结论： 肺内CGRP和5HT阳性细胞的随龄变化显示其在肺的发育、分化、成熟的变化过程中具有重要作用，出生前后其数量变化明显的现象，可能与此阶段肺功能的急剧改变有关. CGRP和5HT的共存表明两者在功能上具有相关性.

　　【关键词】 肺神经内分泌细胞;降钙素基因相关肽;5羟色胺;免疫组织化学;激光扫描共聚焦显微镜

　　0引言

　　肺神经内分泌细胞(pulmonary neuroendocrine cell, PNEC)在胚胎发育过程中异常活跃，与其在正常成体肺组织存在很大的差异，对胚胎肺的发生、发育有着重要作用[1，2]. 我们对出生前后大鼠肺内降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide, CGRP)、5羟色胺(5hydroxytryptamine, 5HT)阳性细胞的随龄变化进行了观察，以期揭示肺内分泌机制的形成和演化过程的形态学基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料兔抗大鼠CGRP抗血清工作液及兔抗大鼠5HT抗血清原液由博士德生物制品公司提供. 生物素标记的兔抗鼠、羊抗兔IgG及辣根过氧化物标记酶卵白素由北京中山生物技术有限公司提供. FITC标记山羊抗兔IgG由北京中山生物技术有限公司提供. 选用健康成年SD大鼠(河北医科大学动物中心提供)， 雌雄2∶1同笼交配，次日08∶00时观察有“阴道栓”，记为怀孕0 d，并将21 d作为鼠的足孕期，共获孕鼠60只. 将实验动物随机分为孕14, 16, 18和20 d,生后1 d,1 wk, 1, 3, 6和18 mo 10个组，每组6只. 按照所需胎龄取孕鼠，迅速活杀孕鼠并打开子宫，取出活的胚鼠，断头并剥开胸腔，浸于Bouin固定液中[3，4]. 成鼠的取材采取结扎气管后迅速断头放血，再行气管灌注，全肺Bouin液内固定的方法. 待肺组织在固定1 h稍变硬后，选取带有各级支气管的左上肺组织多块，作冠状切面，固定12 h[5，6];常规石蜡包埋，连续切片，片厚6 μm，裱于涂有APES载玻片上，37℃烘干备用.

　　1.2方法常规石蜡切片脱蜡至水、依次过氧化氢甲醇封闭，正常山羊血清、CGRP和5HT(1∶50)一抗，4℃冰箱过夜. 生物素标记的1∶100兔抗鼠IgG. 1∶100辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素. DABH2O2显色3 min，自来水停显，脱水，透明，中性树胶封固. 分别用CGRP和5HT一抗与FITC结合的山羊抗兔IgG作为荧光抗体进行单标，用Leica TCSNT型激光共聚焦激光显微镜扫描FITC标记的组织不同层面的荧光强度. 图像用ZL2000高清晰细胞分析系统(河北医科大学实验动物中心提供)软件进行分析，并在荧幕上观察、数字化照像系统摄片. 每只动物取3张切片，每张切片随机选取15个有支气管腔的视野，应用计算机图像分析系统计数气管上阳性细胞和阴性支气管上皮细胞数，求出其阳性细胞率.

　　统计学处理：所得数据以x±s来表示;用医学统计SPSS软件处理，采用多个样本均数的单因素方差分析和多个样本均数间两两比较的q检验.

　　2结果

　　2.1免疫组织化学染色观察CGRP免疫反应阳性细胞可为单个神经内分泌细胞(neuroendocrine cell, NEC)或多个神经内分泌细胞组成的神经上皮小体(neuroepithelial bodies, NEB). 最早见于16 d胚的原始肺泡壁内;随着胎龄的增大，则见于各级支气管的管壁及原始肺泡壁内且数量逐渐增多. 在胚胎16 d组CGRP阳性细胞表现为少量单个零散分布，以球形和卵圆形多见，染色较浅，未见有NEB出现(Fig 1A);在胚胎18 d组阳性细胞数量明显增加，在叶支气管、小支气管、细支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管和肺泡导管管壁的粘膜上皮间均有分布，以气管分叉处多见，其形状可呈卵圆形、锥形、不规则形，位于气管的靠近基膜的粘膜上皮深层， NEB较为常见，通常由3~15个柱形或锥形细胞排成一排. 另外，阳性细胞的染色较胚胎16 d组加深，但着色不均匀;胚胎20 d组阳性细胞数量很多(P<0.01)，而且NEB很常见且多连续分布于气管壁上(Fig 1B). 出生后阳性细胞数量随日龄增加而减少(P<0.01)，在有些NEB的基底部可观察到呈CGRPIR阳性的神经纤维(Fig 1C). 5HT阳性细胞胚胎14 d组未见阳性细胞;胚胎16 d组出现的阳性细胞形态不规则，以球形和扁平形多见，很多细胞有一较长的突起，位于原始肺泡壁内和肺内支气管上皮靠近基膜处(Fig 2A);随胎龄增大阳性细胞数量增多，以胚胎20 d组为最多(P<0.01). 胚胎晚期阳性细胞可见于各级支气管粘膜壁上，单个阳性细胞多为锥状，底部位于基膜，亦可见到2个或2个以上的5HT阳性细胞排列在一起形成的NEB(Fig 2B). 出生后5HT阳性细胞数量急剧减少(P<0.01，Fig 2C，Tab 1). 用相邻切片分别标记CGRP和5HT，可见多数CGRP和5HT可共存于同一NEC中(Fig 3A, B).

　　表1大鼠胎肺CGRP和5HT免疫阳性细胞表达率(略)

　　Tab 1Positive ratio of CGRP and 5HT cells(略)

　　2.2激光扫描共聚焦显微镜观察在共聚焦显微镜下胚胎14 d组的肺组织内未见CGRP和5HT免疫荧光阳性反应物;在胚胎16 d组，有少量荧光强度较低的卵圆形阳性细胞出现;之后，随胎龄增加，细胞数量增加且荧光强度增强(Fig 4 A, B; 5 A, B)，生后各组间阳性细胞内的荧光强度较弱.

　　图1CGRP神经上皮小体，胚胎大鼠肺组织CGRP阳性细胞(略)

　　Fig 1CGRP postive cells and NEB in the pulmonary tissue of fetal rat (brown color stained by DAB) CLSM×400(略)

　　A: 16 d; B: 20 d; C: Postnatal 7 d.

　　图2胚胎大鼠肺组织5HT阳性细胞(略)

　　Fig 25HT positive cells in the pulmonary tissue of fetal rat (brown color stained by DAB)CLSM×400(略)

　　A: 16 d; B: 20 d; C: Postnatal 7 d.

　　A: CGRP masculine;B: 5HT masculine.

　　图3相邻切片法示CGRP(A)，5HT(B) 共存于同一NEC中(略)

　　Fig 3Adjacent sections showing the coexistence of CGRP(A) and 5HT(B) in one NECCLSM×400(略)

　　3讨论

　　5HT和CGRP阳性细胞最早出现在胚胎16 d的肺组织中，细胞染色浅，多见于原始肺泡壁内. 随着胎龄的增加，此类细胞着色加深，见于叶支气管、小支气管、终末细支气管、呼吸性细支气管和肺泡导管管壁的粘膜上皮细胞间;其数量显著增加，胚胎20 d时达到高峰;出生后5HT阳性细胞急剧减少，而CGRP阳性细胞则呈现较为缓慢的下降趋势. 另外，这类细胞常常多个聚集在一起形成NEB，其中以CGRP阳性的NEB较为常见. 激光共聚焦显微镜观察结果显示阳性细胞的荧光强度在胚胎时期随胎龄增长不断增加，出生前达到最高水平，这反映了NEC分泌水平的变化. 5HT阳性NEC变化的原因可能是由于在胚胎时期，肺的导气部及呼吸部含氧量比较低，因而刺激5HT阳性NEC代偿性增加，并发挥其内分泌功能，通过释放5HT引起肺内血管收缩来维持肺内动脉的紧张性，以适应尚未建立呼吸运动的肺的功能作用;出生后，随着呼吸运动的建立、环境及肺内支气管氧气含量充足，依靠血管紧张性的改变来调节呼吸活动的作用逐渐退居次要地位，因而5HT阳性NEC从数量、分布和表达水平都发生了废用性退化[7].

　　CGRP和5HT阳性NEC数量在胚胎时期随胎龄不断增加，其高峰期都在胚胎20 d组，而在出生后其数量均显著减少;同时相邻切片法证实二者可共存于同一NEC中;这个结果提示CGRP和5HT阳性NEC在功能上可能具有相关性. 生理学和药理学的研究结果已经证明5HT具有收缩血管的功能，而CGRP是一种具有较强地舒张血管作用的多肽类活性物质. CGRP和5HT共存的意义尚不十分清楚，推测胺类递质可能参与神经内分泌细胞调节肽的合成、贮存和分泌[8，9]. 另外，已证实CGRP能明显舒张由5HT所引起的肺动脉收缩. 并且，CGRP还可以降低由低氧所致的肺动脉血压过高及左心室的压力[10，12]. 根据CGRP与5HT在同一NEC的共存性，以及它们在出生前后在数量、分布和分泌水平上所表现出的变化的一致性，我们推测在肺发育的胚胎时期，两者共同调节了肺内血管的紧张性，影响着肺循环的局部调节，对肺的发育和功能建立起到了非常重要的作用. CGRP阳性细胞具有较5HT阳性细胞持续时间长，数量减少缓慢的特点，提示CGRP阳性细胞可能具有更为复杂的作用.

　　图4胚胎大鼠肺组织，CGRP免疫荧光阳性细胞(略)

　　Fig 4CGRP immunofluorescence positive cells in the pulmonary tissue of fetal rat(A: 16 d; B: 20 d)×400(略)

　　图5胚胎大鼠肺组织，5HT免疫荧光阳性细胞(略)

　　Fig 55HT immunofluorescence positive cells in the pulmonary tissue of fetal rat(A: 16 d; B: 20 d)×400(略)

　　【参考文献】

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