PGC1基因Thr394Thr多态性与Ⅱ型糖尿病关系的研究

　　作者：张子波 作者单位：延边大学基础医学院　细胞生物学与医学遗传学教研室，吉林 延吉 133000

　　【摘要】 探讨延边地区朝鲜族及汉族人群PGC1基因Thr394Thr多态性与Ⅱ型糖尿病的相关性.[方法]采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCRSSCP)方法对104例糖耐量正常者和113例Ⅱ型糖尿病患者的PGC1基因Thr394Thr多态性基因型进行对照研究.[结果]朝鲜族和汉族正常人PGC1基因Thr394Thr多态性的A等位基因频率分别为23.3%，20.7%;糖耐量正常组及Ⅱ型糖尿病组人群的PGC1基因Thr394Thr多态性的A等位基因频率均为22.1%.[结论]延边地区朝鲜族和汉族人群PGC1基因Thr394Thr多态性间无显著性差异;PGC1基因Thr394Thr多态性与Ⅱ型糖尿病发病无相关性.

　　【关键词】 多态性 单核苷酸 糖尿病 Ⅱ型 人种群

　　Study on relationship of PGC1 gene Thr394Thr polymorphism and type 2 diabetes mellitus

　　ZHANG Zibo1,　L Fuqing2,　WANG Weijie3,　LI Bo1，　YANG Kangjuan1,　JIN Yuanzhe4

　　(1.Department of Cell Biology and Medical Genetics, Yanbian University College of Basic Medicine, Yanji 133000;2.Department of Internal Medicine, Dunhua City Hospital, Dunhua 133700;3.Department of Hormonology，　Hunchun City Hospital,　Hunchun 133300;4.Department of Physiology and Pathophysiology, Yanbian University College of Basic Medicine, Yanji 133000：Jilin, China)

　　ABSTRACT:OBJECTIVETo determine the correlation of peroxisome proliferators activated receptorγ coactivator 1(PGC1) gene Thr394Thr polymorphism and type 2 diabetes mellitus (T2DM) for KoreanChinese and Han nationality in Yanbian area.METHODSPGC1 gene Thr394Thr polymorphism in 104 cases of normal glucose tolerant (NGT) and 113 cases of T2DM was detected by PCRSSCP.RESULTSThe A allele frequencies of NGT in KoreanChinese and Han nationality were 23.3% and 20.7%, respectively, and there was no significant difference between two groups. The A allele frequencies of NGT and T2DM subjects were all of 22.1%.CONCLUSIONThere was no difference in frequency distribution of PGC1 gene Thr394Thr polymorphism between KoreanChinese and Han nationality in Yanbian area, and the PGC1 gene Thr394Thr polymorphism was not associated with T2DM.

　　Key words:polymorphism, single nucleotide;diabates mellitus, type2;ethnic groups

　　过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子1(peroxisme proliferatoractivated receptouγ， PGC1)是新颖的核受体家族的转录共激活蛋白,是过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)的转录辅激活因子[1].该基因定位于人类染色体4p15.1，全长为6kbp，由13个外显子和12个内含子组成[2].PGC1对体内能量代谢有调控作用，提示它可能与肥胖、Ⅱ型糖尿病及脂代谢密切相关.本研究应用聚合酶链反应单链构象多态性(PCRSSCP)技术探讨了延边地区朝鲜族及汉族人群PGC1基因Thr394Thr多态性与Ⅱ型糖尿病的关系.

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 在吉林省延边地区，遵循自愿知情的原则随机选择217名被调查者，对象间均无血缘关系，且双亲连续三代均为同一民族.Ⅱ型糖尿病的诊断参照1999年世界卫生组织(WHO)制定的Ⅱ型糖尿病诊断标准进行.研究对象中糖耐量正常者为104名，列入糖耐量正常组(NGT)，其中朝鲜族为46人，男女比例为100∶96，年龄为31～63岁，汉族为58人，男女比例为100∶106，年龄为32～60岁;Ⅱ型糖尿病者为113名，列入为Ⅱ型糖尿病组(T2DM)，其中朝鲜族为48人，男女比例为100∶104，年龄为45～66岁，汉族为65人，男女比例为100∶109，年龄为46～67岁.

　　1.2 方法

　　1.2.1 人类基因组DNA的提取及鉴定 取酸性枸橼酸葡萄糖(ACD)抗凝全血3mL，置于-80℃冰箱冻存.基因组DNA的提取严格按照小量全血DNA提取试剂盒(由北京华美生物工程公司提供)说明书步骤进行操作，4℃条件下保存.利用DNA/RNA蛋白测定仪测定DNA纯度.结果示所有被检样品质量浓度均在200mg/L以上;OD260nm/OD280nm比值大于1.6，提示DNA纯度良好.

　　1.2.2 PCR扩增 PCR反应总体积为25μL，引物序列为，上游引物5′TGGTGGACACGAGGAAAG3′，下游引物5′CTGCCAATCAGAGGAGACAT3′;扩增片段大小为166bp，模板DNA为100ng，dNTP为200μmol/L，上游引物及下游引物质量浓度均为12.5pmol/L，TaqDNA聚合酶为1U，扩增循环参数为95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，循环前反应液95℃预变性3min，最后72℃延伸10min.反应在PCPersonal Cycler (Biometra) PCR扩增仪上进行，所用试剂均为北京华美生物工程有限公司产品.

　　1.2.3 SSCP检测 取PCR扩增产物8μL，加入2μL变性剂(950g/L甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.2g/L溴酚蓝)，98℃加热变性10min，取出后立即放入冰浴中2min以上.在4℃条件下，将全部水相上样于12g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上，在300V条件下电泳8h，取出凝胶行银染，观察显示条带情况.

　　1.2.4 DNA序列测定 选取SSCP结果具有代表性的PCR产物3份进行DNA序列测定，以确保SSCP结果判读的正确性.

　　1.2.5 统计学处理 运用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率，利用HardyWeinberg遗传平衡定律检验研究样本的群体代表性.所有统计运算均在SPSS11.1统计软件中进行，两组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验进行.

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳检测结果示，目的片断长度为166bp，与理论设计相符(图1).

　　图1 琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物显示图2.2 SSCP检测 SSCP电泳检测结果结合序列报告分析显示，所检测的基因型组配形式如下：位置偏下的2条带示纯合野生型GG;位置偏上的2条带示纯合突变型AA;3条异常带示杂和突变型GA(图2)，图3为序列检测结果.

　　2.3 糖耐量正常组朝鲜族与汉族人群PGC1基因型频率和等位基因频率的比较 由表1可见，糖耐量正常组朝鲜族及汉族人群PGC1基因Thr394Thr多态性位点基因型及等位基因频率间均无显著性差异(P>0.05);朝鲜族及汉族人群PGC1基因Thr394Thr等位基因中G的频率较高.

　　2.4 Ⅱ型糖尿病组及糖耐量正常组朝鲜族与汉族人群PGC1基因型及其等位基因频率的比较 由表2及表3可见，Ⅱ型糖尿病组与糖耐量正常组朝鲜族与汉族人群PGC1基因型及其等位基因频率间均无显著性差异(P>0.05);两组基因型频率均以GG纯合子多见，等位基因频率均以G多见.

　　图2 PGC1基因Thr394Thr等位基因的SSCP电泳结果图3 PGC1基因Thr394Thr等位基因的序列检测结果表1 糖耐量正常组组内PGC1基因Thr394Thr基因型和等位基因频率的比较表2 Ⅱ型糖尿病组及糖耐量正常组汉族人群PGC1基因Thr394Thr多态性分布 表3 Ⅱ型糖尿病组及糖耐量正常朝鲜族人群PGC1基因Thr394Thr多态性分布

　　3 讨论

　　PGC1基因是1998年作为核激素受体PPARγ转录辅激活因子在小鼠体内被发现的，有多种核激素受体的结合位点，它参与了体内调节性生热作用，即线粒体的生物形成、脂肪酸β氧化及葡萄糖转运等.PGC1基因水平的改变与肥胖、糖尿病以及脂代谢紊乱密切相关，因此PGC1基因可作为Ⅱ型糖尿病发病的候选基因.NCBI的dbSNP数据库显示，PGC1基因存在398个SNPs位点.Kondo等[3]应用SNPs对日本537名Ⅱ型糖尿病患者和417名非糖尿病者的PGC1基因进行比较分析，发现Thr394Thr多态性位点，而单倍型分析显示394ThrGly482Ser与Ⅱ型糖尿病发病明显相关.Vimaleswaran等[4]对印度882名正常人和515例Ⅱ型糖尿病患者进行研究发现，Thr394Thr多态性对Ⅱ型糖尿病发病有相关性，基因型为GA者引发Ⅱ型糖尿病的几率较基因型为GG者高1.6倍.路文盛等[5]采用PCRSSCP结合直接序列测定对50例广东籍Ⅱ型糖尿病患者PGC1基因13个外显子区进行扫描，发现Thr394Thr多态性位点，但Thr394Thr多态性与Ⅱ型糖尿病无相关性[5].本研究结果表明，正常组朝鲜族人群PGC1基因Thr394Thr多态性A等位基因频率较汉族低,但无显著性差异，提示中国延边地区的朝鲜族和汉族人群基因频率可能不存在民族间差异，遗传结构基本相同，亲缘性较近，与杜若浦[6]的报道相符.在Ⅱ型糖尿病组朝鲜族患者的A等位基因频率高于汉族，但亦无显著性差异，提示PGC1基因Thr394Thr多态性可能不是延边地区Ⅱ型糖尿病的危险因素.综上所述，PGC1基因Thr394Thr多态性在延边地区朝鲜族和汉族人群中以GG基因型分布为主，且不存在民族间差异;PGC1基因Thr394Thr多态性与延边地区朝鲜族和汉族人群Ⅱ型糖尿病发病无相关性.

　　【参考文献】

　　[1] Puigserver P， Wu Z， Park CW， et al..Coldinducible coaofivator of nuclear receptors lined to adaptive themogensis[J].Cell,1998,92(6):829.

　　[2] Esterbauer H，　Oberkofler H，　Krempter F，　et al..Human peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator1(PPARGC1) gene:cDNA sequence,　genomic organization,　chromosmal localization,　and tissue expression[J].Genomics，1999，62:98.

　　[3] Kondo H, Shimomura I, Matsukawa Y， et al..Association of adiponectin mutation with type2 diabetes[J].Diabetes,2002,51:2325.

　　[4] Vimaleswaran KS，　Radlha V，　Ghosh S， et al..Peroxisome proliferatoractivated receptorgamma coactivatorlalpha (PGC1 alpha) gene polymorphisms and their relationship to Type 2 diabetes in Asian Indians[J].Diabet Med,2005,22(11):1516.

　　[5] 路文盛，成桦，黄勤，等.Ⅱ型糖尿病PGC1基因核苷酸多态性筛查及Gly482Ser变异分析[J].中国糖尿病杂志，2006，14(3)：192.

　　[6] 杜若浦.中国人类群体遗传学[M].北京：科学出版社，2004.761.