携带人脂联素基因重组腺病毒的构建及表达

　　作者：陈 闽， 何 姜， 刘小莺， 黄敬泽， 王林曦， 刘礼斌 作者单位：建医科大学 附属协和医院内分泌科、福建省内分泌研究所，福州 350001

　　【摘要】目的 构建携带人脂联素基因的重组腺病毒载体，为进一步研究脂联素的功能提供实验基础。 方法 以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应扩增人脂联素基因APM1，并将其定向克隆于真核表达载体pDC315EGFP，与辅助质粒pBHGlox⊿E1，3Cre共转染HEK293细胞，经位点特异重组包装得到重组腺病毒AdAPM1。通过Realtime PCR和Western blot分别检测重组腺病毒AdAPM1感染HEK293细胞后的表达。 结果 重组腺病毒AdAPM1包装成功，病毒滴度>6.3×1012pfu/mL。Realtime PCR和Western blot检测证实APM1在HEK293中表达。 结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了携带人脂联素基因的重组腺病毒。

　　【关键词】 胞间信号肽类和蛋白质类 基因 转染 腺病毒科

　　脂联素亦称Acrp30(30 KDa脂肪补体相关蛋白)、GBP28(28 KDa凝胶结合蛋白)、APM1(脂肪组织最丰富的基因转录产物)等，是由Scherer等人于1995年从诱导分化的鼠脂肪细胞中最早发现的具有244个氨基酸的多肽[1]。由于其具有改善胰岛素抵抗、促进血浆游离脂肪酸氧化、抗动脉粥样硬化等作用而成为近年研究的热点[24]。本研究旨在体外构建人脂联素基因腺病毒载体及检测其表达，为进一步研究脂联素的功能及调控机制提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂及仪器 内切酶EcoRI、SalI(美国NEB公司)，T4 DNA ligase(美国NEB公司)，Taq polymerase(日本Takara生物公司)，dNTP(美国Promega公司)，Plasmid抽提 Kit(德国QIAGEN公司)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，携带人脂联素基因的质粒pINCYAPM1(美国OpenBiosystems生物公司)，Mouse antiFlag抗体(美国Sigma公司)HEK293细胞(美国ATCC公司)，真核表达载体pDC315EGFP(上海吉凯生物公司)，辅助包装质粒pBHGlox ΔE1，3 Cre(加拿大Microbix公司)，PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，Real time PCR仪 (美国BioRad公司)，CO2培养箱(日本SANYO公司)，电泳仪(美国BioRad公司)。引物(中国吉凯公司合成)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 腺病毒穿梭质粒pDC315APM1的构建及鉴定 以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，聚合酶链反应克隆人脂联素基因APM1，随后以EcoRI、SalI双酶切聚合酶链反应扩增产物及真核表达载体pDC315EGFP，纯化酶切产物后进行定向连接，转化大肠杆菌感受态细胞，铺板，将长出的克隆通过PCR和测序鉴定。

　　人脂联素cDNA片段引物(778 bp，用于PCR获取目的基因，有下划线的24个碱基序列代表flag tag序列，PCR产物片段长)：

　　上游：5’CCGGAATTCATGCTGTTGCTGGGAGCT

　　G3’

　　下游：5’ACGCGTCGACTCACTTGTCATCGTCAT

　　CCTTGTAGTCGTTGGTGTCATGGTAGAGAAG3’

　　用于PCR鉴定目的基因定向连接的阳性克隆菌落的引物(477 bp，上游引物的设计位于基因内部，下游引物设计位于载体)：

　　上游：5’GTAAAGCGAATGGGCATG3’

　　下游：5’ACGTGGGTATAAGAGGCG3’

　　1.2.2 重组腺病毒AdAPM1的包装 HEK293细胞转染前1天传代，使得转染时细胞汇合率为50%～60%，采用脂质体法将腺病毒穿梭质粒pDC315APM1和辅助质粒pBHGlox⊿E1，3Cre双质粒共转染HEK293细胞，待大部分细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)后低速离心收集细胞，并重悬于2 mL PBS中，-70 ℃/37 ℃反复冻融，振荡3次，;离心收集上清，此成为病毒原液，-80 ℃保存。

　　1.2.3 重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定 取上述病毒原液重新感染HEK293细胞，待大部分细胞CPE完全形成后，收集细胞，PBS重悬，冻融细胞，离心收集上清，-80 ℃保存。按AdenXTMvirus Purification Kit(BD Biosciences，Clontech)的步骤纯化重组腺病毒。采用终点稀释法对腺病毒滴度进行测定，公式：

　　病毒滴度=10(x+0. 8)(pfu/mL)

　　1.2.4 重组腺病毒的鉴定

　　1.2.4.1 腺病毒感染检测 取包装过程中的转染后第12天的细胞培养上清液，10 000 r/min离心1 min，吸出上清液加入到6 cm dish 中的Hek293细胞中，观察细胞生长情况。

　　1.2.4.2 重组腺病毒感染HEK293后脂联素mRNA表达的检测 感染前1天将生长良好的HEK293细胞按5×104mL-1接种于24孔板中，用感染复数(multiply of infection，MOI)为50的腺病毒感染细胞，感染时间达到2 d后收集细胞，抽提RNA进行Realtime PCR检测实验。用于Realtime PCR检测实验的引物，扩增片段(192 bp)：

　　上游：5’TTGCCTACCACATCACAGTC3’

　　下游：5’GTCCATTACGCTCTCCTTCC3’

　　1.2.4.3 重组腺病毒感染HEK293后脂联素蛋白表达的检测 通过检测FLAG 表达，间接检测脂联素蛋白的表达。腺病毒感染HEK293细胞后2 d，收集细胞，制备蛋白样品，10%SDSPAGE电泳，将电泳后的蛋白经湿转法转移至PVDF膜上，常规5%脱脂奶粉室温封闭2 h，Mouse antiFlag抗体(1∶2 000)为一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，AntiMouse IgG抗体(1∶5 000)为二抗，室温孵育1 h，漂洗后ECL显色。

　　2 结 果

　　2.1 人脂联素基因的PCR产物及腺病毒穿梭质粒pDC315APM1的鉴定 以带有人脂联素基因的质粒pINCYAPM1为模板，设计合成人脂联素cDNA片段引物，通过PCR克隆出人脂联素基因APM1，扩增出约778 bp DNA片段，行琼脂糖凝胶电泳(图1);人脂联素基因定向克隆至真核表达载体pDC315EGFP，转化大肠杆菌感受态细胞，铺板，将长出的克隆行菌落PCR鉴定，以设计的第二对引物APM1SEQR、pDC313SEQF，通过PCR扩增出约477 bp DNA片段;阳性克隆送测序，碱基序列与人脂联素基因NM_004797.2开放读码框的序列一致。1. Marker; 2.PCR产物.

　　2.2 转染后显微镜观测 脂质体法将腺病毒穿梭质粒pDC315APM1和辅助质粒pBHGlox⊿E1，3Cre双质粒共转染HEK293细胞，转染后第13天，HEK 293细胞开始飘落，部分细胞出现细胞病变。

　　2.3 腺病毒滴度测定 采用终点稀释法测得纯化后的腺病毒的滴度>6.3×1012 pfu/mL。

　　2.4 重组腺病毒的鉴定

　　2.4.1 腺病毒感染检测 该培养上清液感染HEK293细胞后能够观测到CPE现象，说明该培养上清液中含有病毒颗粒。

　　2.4.2 重组腺病毒感染HEK293后脂联素mRNA表达的检测 感染过目的病毒细胞样品中，目的基因的表达水平远远高于空细胞组(图2)。

　　黑色:Con 为空细胞组，红色代表200 μL，蓝色代表20 μL，绿色代表8 μL的培养上清液感染HEK293 细胞样品组，在Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)为13～15之间的红蓝绿黑各2条曲线分别是它们各自的Actin Ct值.

　　2.4.3 重组腺病毒感染HEK293后脂联素蛋白表达的检测 通过Western blot的X光显影胶片上的条带信息，在目的病毒感染HEK293组可见30 KD左右的阳性条带(图3)。 1：marker;2：FLAG系统阳性对照(含有Flag标签蛋白的细胞裂解产物);3：空孔;4：CON(对照空HEK293细胞);5：目的病毒感染HEK293组;6：目的病毒感染HEK293组;7：携带GFP的重组空白病毒;8：目的病毒包装质粒转染HEK293组.

　　3 讨 论

　　脂联素的基因治疗有望为糖尿病及其并发症的防治提供新的思路。Satoh等人发现，对雄性Wistar大鼠静脉内注射携带脂联素基因的腺病毒，可改善其骨骼肌胰岛素的敏感性[5]。Li等通过注射携带脂联素基因的重组腺病毒载体，对新西兰大白兔动脉粥样硬化模型的腹主动脉内膜进行局部转染，发现可使动脉粥样硬化面积有明显的缩小，并可有效降低血管细胞粘附分子1 mRNA、细胞间粘附分子1 mRNA的表达[6]。也有研究表明，腺病毒介导的全长型、球型脂联素基因转染载脂蛋白E缺陷小鼠，对其动脉粥样病变有明显的缓解作用[7]。同时它也对肥胖小鼠的内皮功能障碍和高血压有很大的改善作用[8]。但是作为一种新发现的激素，脂联素的生理病理作用及作用机制尚未明确。

　　腺病毒载体因其宿主范围广、制备滴度高、感染效率高、对人致病性低、大多数人类蛋白都可得到高水平表达并且具有完全的功能、表达时间较长、不整合到宿主染色体中等优点而成为基因治疗、基因功能研究最常用的载体之一[9]。本实验采用AdMax包装系统，将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染293细胞，利用Cre/loxP系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。该系统的优点在于：操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高;在真核细胞内重组出病毒，保持了对腺病毒的生存压力，有助于重组腺病毒的基因组的完整性;目的基因的表达水平高(因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍)等。本实验成功构建了携带人脂联素基因的腺病毒，经纯化后得到较高的滴度，能有效感染HEK293细胞，并可检测到脂联素蛋白的表达，为今后进一步研究脂联素改善糖尿病及糖尿病大血管并发症提供实验基础。

　　【参考文献】

　　[1] Scherer P E，Williams S，Fogliano M，et al. A novel serum protein similar to C1q， produced exclusively in adipocytes[J]. J Biol Chem， 1995，270(45)：2674626749.

　　[2] Yamauchi T，Kamon J，Waki H，et al. The fatderived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity[J]. Nat Med， 2001，7(8)：941946.

　　[3] Fruebis J，Tsao T S，Javorschi S，et al. Proteolytic cleavage product of 30kDa adipocyte complementrelated protein increases fatty acid oxidation in muscle and causes weight loss in mice [J]. Proc Natl Acad Sci USA 2001，98(4)：20052010.

　　[4] Okamoto Y，Kihara S，Ouchi N，et al. Adiponectin reduces atherosclerosis in apolipoprotein Edeficient mice[J]. Circulation， 2002，106(22)：27672770.

　　[5] Satoh H，Nguyen M T，Trujillo M，et al. Adenovirusmediated adiponectin expression augments skeletal muscle insulin sensitivity in male Wistar rats[J]. Diabetes， 2005，54(5)：13041313.

　　[6] Li C J，Sun H W，Zhu F L，et al. Local adiponectin treatment reduces atherosclerotic plaque size in rabbits[J]. J Endocrinol， 2007，193(1)：137145.

　　[7] Yamauchi T，Kamon J，Waki H，et al. Globular adiponectin protected ob/ob mice from diabetes and ApoEdeficient mice from atherosclerosis[J]. J Biol Chem， 2003，278(4):24612468.

　　[8] Ohashi K，Kihara S，Ouchi N，et al. Adiponectin replenishment obesityrelated hypertention[J]. Hypertension， 2006，47(6)：11081116.

　　[9] 冯 霞，余双庆，陈国敏，等.含HIV1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志， 2004，18(4)：312315.