α硫辛酸对糖尿病大鼠胰腺β细胞凋亡的影响

　　作者：牛力， 赵 湜*， 毛 红 作者单位：(武汉市中心医院内分泌科，湖北 武汉 430014)

　　【摘要】 目的：探讨α硫辛酸对1型糖尿病大鼠胰腺β细胞凋亡的作用机制。方法：20只雄性Wistar大鼠制作1型糖尿病模型后随机分为α硫辛酸组和糖尿病组，α硫辛酸组腹腔注射α硫辛酸50 mg/kg，连续4周，糖尿病组大鼠腹腔注射同体积的生理盐水。每周检测各组大鼠空腹血糖和胰岛素水平，Western blot检测胰腺组织中Caspase3和Bcl2的含量。另取10只雄性Wistar大鼠作为正常对照。结果：4周后α硫辛酸组大鼠空腹血糖显著低于糖尿病组(P<0.05)，但胰岛素值逐渐升高超过糖尿病组(P<0.05)。胰腺β细胞中Caspase3的表达显著低于糖尿病组(P<0.05)，Bcl2的表达则显著高于糖尿病组(P<0.05)。结论：α硫辛酸可能通过线粒体途径减少β细胞凋亡而发挥保护作用。

　　【关键词】 1型糖尿病;α硫辛酸;线粒体;凋亡

　　Effects of Alphalipoic Acid on Pancreatic β Cells Apoptosis in Diabetic Rats NIU Li,ZHAO Shi*,MAO Hong (Department of Endocrinology,Central Hospital of Wuhan,Wuhan,Hubei 430014,China)

　　Abstract： Objective To study the antiapoptotic effects of alphalipoic acid and its possible mechanism in typeⅠ diabetic rats.Methods The typeⅠ diabetic models were established in 20 male wistar rats,then divided into alphalipoic acid group and diabetic group randomly.The two groups were respectively given intraperitoneal injection of alphalipoic acid and intraperitoneal injection of normal saline for 4 weeks.Fasting blood glucose and plasma insulin of each group were measured every week.Western blot were performed to detect the contents of Caspase3 and Bcl2 in pancreastic tissues.Another 10 rats were selected as normal control.Results After 4 weeks,the fasting blood glucose in alphalipoic acid group was significantly lower than that of diabetic group(P<0.05),but the insulin value was increased in alphalipoic acid group and even higher than that of diabetic group(P<0.05).The expression of Caspase3 in alphalipoic acid group was significantly lower than that of diabetic group(P<0.05),while the expression of Bcl2 was opposite(P<0.05).Conclusion Alphalipoic acid could protect pancreatic β cells from apoptosis through the mitochondrial pathway.

　　Key words TypeⅠ diabetes mellitus;Alphalipoic acid;Mitochondrion;Apoptosis

　　1型糖尿病是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，表现为胰腺β细胞的选择性损伤和细胞凋亡。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关，它起中心调控作用，可以决定细胞的生存或死亡[1]。α硫辛酸(Alpha Lipoic Acid,αLA) 是已知天然抗氧剂中效果最强的一种，其可清除体内的多种反应性氧自由基，还原人体内的抗氧化系统，增强机体的抗氧化能力。本研究通过观测α硫辛酸对1型糖尿病大鼠胰腺β细胞凋亡的影响并探讨其可能的作用机制，为1型糖尿病防治提供新的思路和策略。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　雄性Wistar大鼠(湖北省疾病预防控制中心)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，α硫辛酸(南京泽朗医药科技有限公司)，胰岛素放免试剂盒(中国原子能院同位素所)，GAPDH抗体、Caspase3抗体和Bcl2抗体(美国Santa Cruz公司)。

　　1.2 1型糖尿病大鼠模型制备及分组

　　雄性Wistar大鼠纯系25只，重约180～220 g左右，不限制饮水。禁食10 h后，用链脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液(pH 4.4)配成1%的溶液，按70 mg/kg体重单次腹腔注射。7 d后取尾静脉血，用One Touch血糖仪测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L并且持续7 d者确认模型制作成功。

　　结果有20只模型制作成功，随机分为α硫辛酸组和糖尿病组，另取10只雄性Wistar大鼠做作为正常组。其中α硫辛酸组给予腹腔注射α硫辛酸50 mg/kg，每2 天注射1次，连续4周，糖尿病组腹腔注射同体积的生理盐水。

　　1.3 血糖和胰岛素水平检测

　　每周定时测大鼠空腹血糖和胰岛素水平。血糖测试使用末梢全血血糖测试仪SureStepPlus(美国Lifescan公司)，采用剪尾取尾静脉血测试。胰岛素放免试剂盒(INS)检测胰岛素。

　　1.4 Western blot检测Bcl2和Caspase3含量

　　大鼠4周后处死，取胰腺100 mg加1 mL裂解液，低温，快速匀浆，12 000 r/min离心，4 ℃，2 min。取等量蛋白经SDSPAGE电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上。丽春红染色PBST洗膜3次，50 g/L脱脂奶粉封闭(4 ℃，12 h)，加入一抗4 ℃过夜。阳性条带以Gel pro 4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其积分光密度IOD值。

　　1.5 统计学处理

　　数据以均数±标准差(x±s)表示，SPSS 11.0统计软件进行资料分析，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05被认为具有统计学差异。

　　2 结果

　　2.1 血糖和胰岛素水平

　　由表1可见，糖尿病组和α硫辛酸组大鼠空腹血糖在实验前均大于16.7 mmol/L，高于正常组。但α硫辛酸组血糖值逐渐降低，第28天其空腹血糖为(18.73±0.59) mmol/L，显著低于糖尿病组 (P<0.05)。表2所示，2组空腹胰岛素水平在实验前均较正常组低，但α硫辛酸组大鼠的空腹胰岛素水平逐渐升高，到第4周时，其空腹胰岛素水平为14.26±1.85) μIU/mL，显著高于糖尿病组 (P<0.05)。表1 各组大鼠空腹血糖值比较注：与糖尿病组比较,*P<0.05表2 各组大鼠空腹胰岛素水平比较注：与糖尿病组比较,*P<0.05

　　2.3 大鼠胰腺中Caspase3和Bcl2的表达

　　图1 Western blot检测Caspase3和Bcl2电泳图

　　实验结束时，正常组大鼠胰腺中Caspase3的IOD值为(30.54±4.52)，α硫辛酸组IOD值为(67.27±6.21)，均显著低于糖尿病组(96.12±8.64)(P<0.05)。正常组大鼠胰腺中Bcl2的IOD值为(279.23±8.79)，α硫辛酸组大鼠胰腺中Bcl2的IOD值为(174.62±6.86)，也都显著高于糖尿病组(115.31±4.35)(P<0.05)。

　　3 讨论

　　线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2+、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用，为细胞的各种生命活动提供基础能量。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关，包括Caspase激活因子释放如细胞色素c、电子传递链的改变、线粒体膜电位丧失、细胞内氧化还原状态的改变等。不同信号的传导最终都集中到线粒体上来启动或抑制这些事件及其效应的发生[2]。研究发现，凋亡早期线粒体结构保持完整，而坏死细胞的线粒体则发生肿胀，因此将其作为凋亡与坏死的一个重要区别。线粒体的结构和功能的改变，能加速核凋亡特征的出现[3]，并是限制细胞凋亡进程中关键的一步。

　　Caspase胱冬肽酶是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶，是在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶家族。Caspase3是线粒体依赖的凋亡途径的主要执行者，它可作为凋亡级联反应中公共下游的凋亡效应因子完成致命性DNA 断裂作用，以诱导细胞凋亡[4]。β细胞淋巴瘤基因2(Bcell lymphoma2,Bcl2)家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键作用的一类蛋白质[5]。它通过与其它凋亡相关因子的协同作用调控着线粒体结构与功能的稳定性，发挥细胞凋亡主开关作用[6-7]。哺乳动物中Bcl2家族主要由抗凋亡的Bcl2、BclX1及促进凋亡的成员如Bax、Bad、Bid等组成，Bcl2、BclX1主要存在于线粒体膜或胞质中，而Bax、Bad、Bid主要存在于胞质中。Bcl2家族对细胞凋亡的调节是多方面的。通过调节线粒体膜电位影响细胞色素c的释放来调节细胞凋亡，Bcl2还能通过保持线粒体内外膜的完整性，增加线粒体内质子的外流，抑制线粒体膜电位的下降[8-9]。

　　α硫辛酸(Alpha Lipoic Acid,αLA) 是一种双硫五元环维生素，其化学名称是1，2二硫戊环3戊酸，是已知天然抗氧剂中效果最强的一种，它可清除体内的多种反应性氧自由基，而且还能还原人体内的抗氧化系统，增强机体的抗氧化能力。关于α硫辛酸对糖尿病胰腺的保护作用和机制已引起广泛的关注。本研究发现经α硫辛酸干预后，大鼠空腹血糖值逐渐降低，而胰岛素水平逐渐升高;同时线粒体促凋亡蛋白Caspase3和抗凋亡蛋白Bcl2的表达也分别降低和升高,提示线粒体凋亡途径参与了1型糖尿病大鼠胰腺β细胞凋亡，而α硫辛酸可减少此类凋亡。由此推测α硫辛酸可能通过减少1型糖尿病大鼠胰腺β细胞线粒体引起的胰腺β细胞凋亡，从而改善大鼠胰岛素分泌功能，亦间接发挥了一定的β细胞保护作用，此为临床防治1型糖尿病提供了一种新的思路和策略。

　　【参考文献】

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