白藜芦醇对高脂鼠肾脏NFκB和MCP1表达的影响

　　作者：丁洪成, 夏文芳, 陈璐璐 作者单位：1郧阳医学院附属人民医院内分泌科，湖北 十堰 442000;2华中科技大学同济医学院附属协和医院内分泌科，湖北 武汉 430030

　　【摘要】 目的:探讨白藜芦醇对高脂饲养大鼠肾脏的保护作用及对核因子κB (NFκB)活性和单核细胞趋化蛋白质(MCP1)表达的影响。 方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、高脂喂养组和白藜芦醇治疗组。喂养16周后，检测各组大鼠的血糖(FPG)，甘油三脂(TG)，胆固醇(TC)，肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)水平及24h尿蛋白定量(uPro);免疫组织化学法检测肾组织中核因子(NFκB) 和单核细胞趋化蛋白质1(MCP1)的表达。结果:白藜芦醇治疗组大鼠体内BS、TG、TC无显著差异;但24 h uPro 、Scr、 BUN均明显降低，肾组织NFκB和MCP1的表达减弱。结论:白藜芦醇可改善高脂大鼠的肾脏功能，可能与其抑制NFκB 活性、降低MCP1的表达有关。

　　【关键词】 脂诱导性肾病;核因子κB;单核细胞趋化蛋白质1;白藜芦醇

　　Effects of Resveratrol on NFκB and MCP1 Expression in Kidney in Hyperlipidemia Rats DING Hongcheng1,2,XIA Wenfang2,CHEN Lulu2*(Department of Endocrinology,1Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

　　Abstract: Objective To investigate the renal protective effect of resveratrol on rats with high fat diet,and effects of resveratrol on NFκB activity and MCP1 expression. Methods Thirty male Wistar rats were randomly divided into normal control group,high fat diet group and resveratrol treated group.The levels of blood sugar(BS),triglyceride(TG),cholesterol(TC), creatinine(Scr),blood urea nitrogen (BUN)and 24 h urinary protein (uPro) were examined respectively after 16 weeks, and the expression of Nuclear Factor Kappa B (NFkB) and monocyte chemoattractant protein1 (MCP1) were analyzed by immunohistochemical staining.Results In resveratroltreated group,there was no significant differences in BS,TG,TC, but 24 h uPro,Scr,BUN were significantly decreased,NFκB and MCP1 expression in renal tissue were decreased.Conclusion Resveratrol could improve the renal function in rats with high fat diet,which is closely related with the inhibition of NFκB activity and decreasing the expression of MCP1 in renal tissue.

　　Key words:Lipidinduced nephropathy;NFκB;MCP1;Resveratrol

　　有研究证实高脂血症在肾脏疾病发生、发展中中是一个重要和独立的影响因素，但其引起肾脏损伤的机制尚不明确[1]。白藜芦醇(Resveratrol)是一类主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎等重要作用。本研究通过建立大鼠高脂血症模型，以探讨白藜芦醇对高脂血症大鼠肾脏的保护作用及其可能的机制。

　　1 实验材料和方法

　　1.1 实验动物

　　雄性Wistar清洁级大鼠30只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)体重180～200 g。置安静、23 ℃～27 ℃、湿度55%、光照12/24 h、通风良好的动物房喂养。适应性喂养一周后，随机分成3组。对照组10只，喂养标准鼠饲料(湖北省实验动物中心);高脂组10只，喂养高脂饲料(标准鼠饲料+胆固醇+猪油+奶粉，其中热量21%来自蛋白质，59%来自脂肪，20%来自碳水化合物);白藜芦醇治疗组10只，喂养高脂饲料+白藜芦醇(武汉博士德公司)灌胃(100 mg·kg-1·d-1)[2]。充足供应食水，每3天更换垫料。

　　1.2 标本采集

　　饲养16周，每2周检查大鼠体重变化，每4周检查大鼠血糖。饲养结束前3 d，收集大鼠的尿标本，送检24 h尿蛋白。饲养结束前1天下午6时开始禁食，次日上午8时大鼠经戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，开腹，经腹腔静脉取血检测血脂、血糖及肾功能。取右肾组织，甲醛固定。

　　1.3 生化指标检测

　　甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)通过自动生化分析仪检测;血糖(FPG)测定采用葡萄糖氧化酶法，24 h尿蛋白(24 h uPro)定量采用双缩脲法测定。

　　1.4 肾脏组织化学及免疫组织化学染色

　　SABC法分别进行NFκB和MCP1免疫组织化学染色。一抗：兔抗大鼠NFκB (p65)多克隆抗体 (1∶100，Sigma)，山羊抗大鼠MCP1多克隆抗体(1∶100，Sigma)。SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。步骤:常规石蜡切片，脱水后加3%双氧水，蒸馏水洗涤3次，行抗原微波修复;1 mmol/L PBS冲洗2次，滴加0.5%山羊血清封闭抗体。加1∶100比例稀释的一抗和生物素化的二抗，加SABC，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作为阴性对照。HMISA2000医学图像分析系统进行吸光度扫描，每张切片采集6个视野，每个视野采集6个肾小球，计算其平均光密度(A)。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据用SPSS 13.0软件处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，两组以上比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2 实验结果

　　2.1 喂养前后大鼠生化指标的变化

　　不同饲料喂养16周后，高脂组大鼠体重、TC、TG、24 h uPro、Scr、BUN均明显高于对照组 (P<0.05);FPG虽升高但还没有达到糖尿病诊断标准。经白藜芦醇干预后，FPG 、TC、TG均没有明显变化(P>0.05);但24 h uPro、Scr、BUN均明显降低(P<0.01)，见表1。表1 各组大鼠FPG、TC、TG、Scr、BUN 和24 h尿蛋白定量注：白藜芦醇组与对照组比较，*P<0.05;与高脂组比较，#P<0.05

　　2.2 各组大鼠肾组织中NFκB和MCP1的表达

　　核因子NFκB阳性产物主要位于细胞核，MCP1免疫组化阳性产物主要位于胞浆内，均呈棕黄色。高脂组肾小球NFκB、MCP1表达明显高于对照组(P<0.05)，但白藜芦醇组NFκB和MCP1的表达量则较高脂组明显下降(P<0.05)。

　　3 讨论

　　高脂血症可诱导和加剧肾损害，促进肾小球硬化。Motoshi等[3]给大鼠给以高胆固醇饲料喂养6周后，大鼠血浆胆固醇升高、蛋白尿，肾小球呈节段性硬化(FSGS)，肾小球均见巨核细胞核浸润及泡沫细胞形成。实验表明脂质不仅介导肾小球损伤，而且在肾小管、肾间质损害中也起重要作用，脂质通过受损的肾小球滤过膜进入系膜区，引起系膜细胞增生和基质增多，滤过的脂质又可被肾小管重吸收，导致肾间质纤维化[4]。抗脂药物特别是HMGCoA还原酶抑制剂对进行性肾损伤具有保护作用，如对Zucker鼠在高脂血症期给予抗脂药物治疗，可使血脂明显降低，尿蛋白减少，系膜细胞增生和基质扩展、肾小球节段硬化减轻[5]。本次试验中，高脂饲料喂养16周后，大鼠体重增加，脂代谢紊乱，尿蛋白排泄率增加，随病情的进展出现肌酐清除率下降，血尿素氮和血肌酐升高，呈现早期肾损害表现。

　　NFκB以可诱导形式存在于所有有核细胞中，它与细胞内抑制物结合，以非活性形式存在胞浆中，参与炎性因子和细胞因子相关基因的表达调控。在肾小球系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞均存在NFκB的转录调控。NFκB通过调控炎性因子和细胞因子的转录过程，在原发性肾小球疾病及继发性肾小球疾病的发生发展中起核心作用。MCP1基因上存在NFκB调控位点，NFκB的表达和激活反过来促进MCP1的表达。MCP1的表达主要受NFκB调控，随NFκB活性的降低而受抑制。作为炎性反应趋化因子，MCP1亦可促进单核细胞和中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，并诱导单核细胞趋化和激活单核细胞释放各种细胞因子，加重炎性反应过程，促进系膜增生及细胞外基质沉积，从而引起肾脏损害。同时肾脏NFκB活性明显增高，肾组织中的MCP1蛋白表达也显著增高，且其活性与蛋白尿程度明显相关，表明NFκB活性增高及MCP1蛋白表达可能是高脂血症引起肾损伤的重要机制。故肾脏功能的改善可能与其NFκB的活性降低有关，NFκB的活性降低则与白藜芦醇抑制其上游通路(即ROS)密切相关。

　　活性氧(ROS)是诱导NFκB活化的重要因素之一。系膜细胞产生 ROS增加，使蛋白激酶C(PKC)磷酸化而激活，而后通过激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导通路，使NFκB表达增强。近年发现氧化应激(oxidative stress，OS)在高脂血症引起肾小球损害发生发展中起着十分重要的作用[6-7]。脂代谢紊乱，特别是高胆固醇血症，会增强肾脏氧化酶活性，致体内ROS产生增加，而机体抗氧化能力如超氧化歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSHPx)、过氧化氢酶(CAT)活性下降，细胞NADPH含量不足，损伤机体的氧化/抗氧化平衡，造成肾组织损伤。高脂血症状态使系膜区沉积的LDL可以通过活性氧分子氧化修饰为OXLDL。内皮细胞和血管平滑肌细胞均能由活性氧分子氧化LDL，血液中增高的OXLDL可能是内皮细胞损伤的始动因素。人肾小球系膜细胞(HMC)起源于血管平滑肌细胞，而OXLDL能刺激HMC中的NFκB活化[8-10]，故推测ROS在NFκB的激活过程中可能扮演着重要角色。许多抗氧化剂能有效抑制NFκB的活化也提示如何尽可能地清除ROS是防治脂质肾损害的一个策略。

　　本试验中，高脂饲料喂养大鼠经白藜芦醇干预后，NFκB的活性显著降低，同时大鼠肾组织MCP1蛋白的表达也显著下降，24 h尿蛋白和肾功能有明显的改善。由此可见，NFκB的激活，是高脂血症引起肾脏损伤的重要机制。在血糖、血脂无明显改善的情况下，白藜芦醇通过抗氧化特性，抑制了高脂血症状态时肾脏ROS，而使下游的NFκB的活性降低，MCP1的表达减少，减轻了肾小球细胞的炎症和增生反应，使肾小球基底膜增厚程度减轻、细胞外基质合成减少，对肾脏起到了一定的保护作用。

　　【参考文献】

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