2型糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜单核细胞趋化蛋白1的免疫组化研究

　　作者：孟馨 张锦 作者单位：中国医科大学附属第一临床医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001

　　【摘要】 目的 探讨MCP1在2型糖尿病患者动脉粥样硬化(AS)内膜的表达。方法 采用免疫组化方法分别检测13例2型糖尿病患者及15例非糖尿病患者AS内膜及7例健康人正常动脉内膜MCP1的表达和分布。结果 正常动脉内膜未见MCP1阳性表达，平均灰度值为232.21±7.16。MCP1在非糖尿病患者AS脂纹期平均灰度值为159.67±8.94，主要分布在内皮细胞及泡沫细胞中;在纤维斑块期为169.51±7.47，主要分布在泡沫细胞，而内皮细胞仅有弱表达，二者表达差异显著(P<0.05)。在糖尿病患者AS脂纹期及纤维斑块期动脉内膜内皮细胞及泡沫细胞中皆有较强表达，脂纹期平均灰度值为124.76±5.44，纤维斑块期为135.56±5.84。糖尿病与非糖尿病患者间表达差异显著(P<0.05)。 结论 高糖环境下刺激内皮细胞产生MCP1增加是促发AS形成的原因之一。

　　【关键词】 单核细胞趋化蛋白 1 动脉粥样硬化 2型糖尿病 免疫组织化学

　　动脉粥样硬化(AS)是一种包括炎性细胞浸润、平滑肌细胞增生、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理过程的慢性炎症疾病。其中，外周血单核细胞黏附于血管内皮细胞并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是AS形成的重要早期事件〔1〕，在此过程中趋化因子发挥了极其重要的作用。单核细胞趋化蛋白1(MCP1)属于CC型趋化因子，是招募单核细胞进入血管壁的重要趋化因子。糖尿病患者由于AS而发生的冠心病、缺血性或出血性脑血管病、肢端坏疽等并发症均明显高于非糖尿病人群,是当今糖尿病患者致死致残的重要原因，确切机制尚不清楚。已有研究表明，糖尿病患者血浆MCP1水平增高，但其在糖尿病患者AS动脉内膜中的表达与分布尚未报道。本研究采用免疫组织化学方法，检测MCP1在2型糖尿病患者和非糖尿病患者AS动脉内膜中的表达与分布，探讨MCP1在2型糖尿病患者动脉粥样硬化形成和发展中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　羊抗人MCP1多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒购自北京中山生物工程有限公司;DAB显色试剂盒、APES购自武汉博士德公司。

　　1.1.1 受试者资料

　　所有动脉标本均来自我院、医大二院及沈阳市红十字会医院外科病房。其中13例2型糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准。

　　1.1.2 标本的处理

　　将术中获得的新鲜标本在离体30 min内用OCT包埋，放入液氮中迅速冷冻形成冻块，取出后用铝箔包好，编号后存入-80℃冰箱中保存。实验前于恒温冰冻切片机制成6 μm厚的冰冻切片，贴于涂有防脱片剂APES的载玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，PBS冲洗，准备用于HE染色、油红O染色及免疫组化。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织学检查

　　冰冻切片经HE染色后在光学显微镜下(倍数×400)行病理分期。①非糖尿病组：正常动脉7例，脂纹期6例，纤维斑块期9例。②糖尿病组：脂纹期5例，纤维斑块期8例。

　　1.2.2 油红O染色

　　固定后的冰冻切片用60%异丙醇浸泡30 s;油红O稀释液55℃浸泡40 min;60%异丙醇浸泡10 s;苏木素染色2 min;自来水冲洗5 min;甘油明胶封片。

　　1.2.3 MCP1免疫组化染色

　　根据北京中山生物工程有限公司提供的技术指导说明进行(SP法)。①滴加3%过氧化氢阻断液，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min。②PBS冲洗(3×5 min)。③滴加正常兔血清封闭液，室温下孵育15 min，倾余，不洗。④滴加羊抗人MCP1多克隆抗体(1∶100)，4℃过夜。⑤PBS冲洗(3×5 min)。⑥滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育15 min。⑦PBS冲洗(5×5 min)。⑧滴加链霉菌抗生素蛋白过氧化酶溶液，室温下孵育15 min。⑨PBS冲洗(3×5 min)。⑩滴加新鲜配制的DAB显色15～20 min，苏木素复染，中性树胶封片。

　　1.3 统计学处理

　　灰度值用x±s表示，采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 免疫组织化学检查

　　7例健康人正常动脉内膜未见棕褐色细颗粒状物沉积，即未见到MCP1阳性表达。在非糖尿病患者不同期的AS动脉内膜中，MCP1呈不同程度的表达，MCP1在脂纹期动脉内膜中的表达明显增多，主要分布在内皮细胞及泡沫细胞中;MCP1在纤维斑块期动脉内膜中的表达逐渐减弱，主要分布在泡沫细胞，而内皮细胞仅有弱的MCP1染色。在糖尿病患者脂纹期及纤维斑块期动脉内膜中，内皮细胞及泡沫细胞中皆有较强的MCP1染色(图1)。

　　2.2 油红O染色

　　健康人正常动脉内膜油红O染色阴性，有AS患者(非糖尿病患者及糖尿病患者)动脉内膜均可见油红O染色阳性(图2)。

　　2.3 MCP1免疫沉积物灰度值分析

　　将免疫组化方法检测的MCP1免疫沉积物，利用计算机图像分析仪进行灰度扫描。灰度值范围0～255，灰度值越小，免疫染色程度越高，即MCP1的免疫沉积越多。非糖尿病组：正常动脉内膜MCP1平均灰度值分别为232.21±7.16;脂纹期动脉内膜平均灰度值为159.67±8.94;纤维斑块期动脉内膜平均灰度值为169.51±7.47。糖尿病组：脂纹期动脉内膜平均灰度值为124.76±5.44;纤维斑块期动脉内膜平均灰度值为135.56±5.84。

　　3 讨 论

　　AS病变是由于血管内皮和平滑肌细胞受各种因素损害而产生的过度的炎症性纤维增殖性反应〔2〕。在各种病因的作用下,血液单核细胞迁入内皮下间隙,被激活分化成巨噬细胞，巨噬细胞能通过其表面的清道夫受体无反馈调节地摄取修饰脂蛋白而形成泡沫细胞。随着脂蛋白内流增多和泡沫细胞在动脉内膜的积聚，形成AS的早期病变——脂纹。AS发展至纤维斑块期，大量泡沫细胞由于自由基的毒性作用坏死崩解，释放胞浆内的脂质，在内膜深层形成脂质池。脂质池的组织结构几乎全部破坏，也见不到泡沫细胞，光镜下可见到大量脂滴及胆固醇结晶在制片过程中形成的裂隙与坏死组织碎屑混合存在〔3〕。

　　MCP1属于CC型趋化因子，是作用于单核细胞的特异趋化蛋白，是引起单核细胞趋化迁入血管内膜下的主要趋化因子;病理条件下，动脉壁细胞(内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞)产生大量MCP1，而MCP1可刺激单核细胞分泌多种细胞因子〔4〕;另外，MCP1还可作用于平滑肌细胞，导致平滑肌细胞分裂、增殖〔5〕，由此可见MCP1在AS的发生、发展过程中起重要作用。

　　糖尿病是临床上一种常见病和多发病，血管并发症是糖尿病患者的主要致残及致死原因。流行病学调查资料表明，糖尿病患者发生AS及危及生命的心血管并发症的危险性较正常人增加了3～4倍。Hayes等〔6〕证实在AS病变中表达MCP1。本研究结果表明①正常动脉内膜未见MCP1阳性表达。②MCP1在非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达明显增多，在纤维斑块期动脉内膜中的表达逐渐减弱。③MCP1在糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达显著增高，与非糖尿病患者脂纹期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05);在糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中仍有较强的表达，与非糖尿病患者纤维斑块期动脉内膜中的表达相比有显著性差异(P<0.05)。

　　我们通过免疫组织化学方法观察到，非糖尿病患者早期及晚期AS中表达MCP1的细胞类型是不一样的，在早期AS中内皮细胞及泡沫细胞是MCP1的主要来源，而晚期AS中泡沫细胞是MCP1的主要来源，此结果与其他报道一致〔7〕;这可能是由于内皮细胞表达MCP1启动单核细胞迁至内皮下间隙。糖尿病患者早期及晚期AS中 表达MCP1的细胞类型均是内皮细胞及泡沫细胞，说明高血糖是导致内皮细胞产生MCP1增加的因素，高糖环境下刺激内皮细胞产生MCP1增加是促发AS形成的原因之一，其机制可能与高糖的直接作用或促使蛋白糖基化进而促进内皮细胞产生MCP1有关。

　　【参考文献】

　　1 Schwartz CJ,Valente AJ,Sprague EA.A modern view of atherogenesis〔J〕. Am J Cardiol,1993;71:9B14B.

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　　3 蔡海江.动脉粥样硬化基础与临床〔M〕.苏州：江苏科学技术出版社,1996：11920.

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　　6 Hayes IM,Nicola JJ,Sewah T,et al.Human vascular smooth muscle cells express receptors for cc chemokines〔J〕.Arterioscler Thromb Vas Biol,1998;18:397403.

　　7 Takeya M,Yoshimura T,Leonard EJ,et al.Detection of monocyte chemoattractant protein1 in human atherosclerotic lesions by an antimonocyte chemoattractant protein1 monoclonal antibody〔J〕.Hum Pathol,1993;24:53439.