cAMP反应元件结合蛋白磷酸化与肝糖输出调控基因表达关系的研究

　　作者：王晶 刘晓民 李艳波 周立红 冯晓红 作者单位：哈尔滨医科大学第一临床医学院内分泌科，黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】 目的 观察CREB磷酸化对肝糖输出调控基因表达的影响。方法 利用cAMP激动剂forskolin处理原代培养的大鼠肝脏细胞，以Western blot法检测肝脏细胞处理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表达变化，以RTPCR方法检测肝糖输出调控基因PGC1α、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)mRNA的表达。结果 以cAMP激动剂Forskolin作用的肝细胞CREB蛋白的磷酸化水平明显增高，肝糖输出调控基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA的表达也增高。结论 CREB磷酸化后可以调控糖异生关键酶的表达。

　　【关键词】 cAMP反应元件结合蛋白 磷酸化 肝糖输出调控基因

　　The relationship between cAMP response elements binding protein phosphorylation and glycogen output controlling gene

　　WANG Jing, LIU XiaoMin, LI YanBo, et al.

　　Department of Endocrinology, the First Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of cAMP response elements binding protein (CREB) phosphorylation on glycogen output controlling gene expressions.Methods The cultured primary liver cells of the rats were treated by cAMP agonist forskolin to detect the expressions of CREB before and after treatment and phosphorylated CREB protein by Western blot. The expressions of PGC1α, PEPCK and G6Pase mRNA were determined by RTPCR. Results After treated by forskolin，the phosphorylated CREB protein level significantly increased, and the expressions of PGC1α, PEPCK and G6Pase mRNA were obviously enhanced. Conclusions As the upstream regulatory factor of PGC1α, the phosphorylated CREB could regulate the key enzymes expressions of gluconeogenesis.

　　【Key words】 cAMP response elements binding protein (CREB); Phosphorylation; Glycogen output controlling gene

　　cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponsive element binding protein，CREB)作为一种转录因子，具有广泛而复杂的功能。研究表明，CREB是体内能源物质代谢的重要调节者,尤其在肝脏的糖代谢方面，对维持机体血糖水平的稳定发挥重要作用〔1，2〕，提示CREB可能对2型糖尿病肝糖输出过多的发生具有重要作用。近年研究表明，糖异生途径的两个关键酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶，PGC1α水平增加可激活糖异生关键酶〔磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)〕，造成肝糖输出的增加，在肝脏胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生发展中发挥重要作用〔3〕。CREB与以上转录因子和糖异生关键酶的关系目前还不十分明确。本研究利用cAMP激动剂forskolin处理原代培养的大鼠肝脏细胞，观察CREB磷酸化对肝糖输出调控基因表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　健康雄性Wistar大鼠，体重150～200 g，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，动物合格证号20040001。

　　1.2 方法

　　1.2.1 试剂

　　高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司，Forskolin购自MerckCalbiochem公司，胶原酶IV购自Sigma公司，新生牛血清购自Gibco公司，抗磷酸化CREB抗体(Ser133)、抗非磷酸化CREB抗体购自Cell signaling technology 公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。表1 逆转录聚合酶链反应引物序列(略)

　　1.2.2 大鼠原代肝脏细胞的分离和培养

　　参照文献〔4〕方法。大鼠腹部消毒后，10 g/L戊巴比妥钠麻醉(2 mg/kg，ip)，开腹,分离肝门静脉,经门静脉插管,开放下腔静脉,以流速10 ml/min灌流37℃ 的前灌流液(142 mmol/L NaCl、6.7 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、pH 7.4)冲洗肝脏中的血液，再以37℃预热的0.0 5 %IV 胶原酶灌流10 min，流速20 ml/min。当肝包膜下肝组织呈龟背状裂隙、胶原酶灌流液充满肝包膜下时停止，去除肝包膜，分离肝细胞，过150目筛,以DMEM清洗细胞，50 g离心5 min，3次获取肝细胞。沉积的肝细胞用含100 ml/L小牛血清DMEM调整密度为2.5×108/L，台盼蓝染色计数细胞活率力>85%，以此密度将细胞分别接种于25 ml培养瓶和6孔板。在DMEM (10% cuff serum)、37℃、20%O2、5%CO2的环境下培养2.5 h后，将细胞清洗一次。之后，再在相同的培养基中培养21.5 h(合计24 h)，用得到的第一代培养肝细胞进行试验。

　　1.2.3 药物干预试验

　　原代肝脏细胞生长至对数生长期时，用含0.3%新生牛血清的DMEM培养基培养12 h，使细胞同步化，再更换无血清的DMEM培养基，以10 μmmol/L(终浓度)的cAMP激动剂Forskolin作用细胞(作用1 h用于Western blot，作用4 h用于RTPCR)，同时设对照组。

　　1.2.4 检测指标

　　以Western blot法检测肝脏细胞处理前后CREB和磷酸化CREB蛋白的表达变化，以GAPDH为内参。以RTPCR方法检测肝糖输出调控基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA的表达，具体方法参考文献〔5，6〕。

　　1.3 统计学分析

　　所有数据输入计算机，以x±s表示，运用SPSS11.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 Forskolin处理前后原代肝细胞CREB、pCREB蛋白的表达

　　见表2。以cAMP激动剂Forskolin作用的肝细胞，与对照组相比，CREB蛋白的磷酸化水平明显增高(P<0.01),而CREB的表达无统计学意义。表2 Forskolin处理前后原代肝细胞CREB、pCREB蛋白的表达(略)

　　2.2 Forskolin处理前后原代肝细胞PGC1α、PEPCK和G6Pase mRNA的表达

　　见表3。以cAMP激动剂Forskolin作用的肝细胞，与对照组相比，肝糖输出调控基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA的表达也增高，差别均有统计学意义(P<0.01)。表3 处理前后原代肝细胞PGC1α、PEPCK和G6Pase mRNA的表达(略)

　　3 讨 论

　　磷酸化与脱磷酸化是调节CREB活性的重要机制之一，目前研究最多的是PKA，在PKA介导下，通过CREB在Ser133位点的磷酸化形成磷酸化CREB和磷酸化ATF1(activating transcription factor 1)，cAMP调节一系列基因的表达。近几年的研究显示，空腹状态下CREB通过抑制PPARγ和诱导PGC1(PPAR Gamma Coactivator)而调节肝脏糖脂代谢〔7〕。

　　糖异生的速率主要靠某些糖异生途径单向酶(关键酶)的激活来控制，如PEPCK、果糖1,6双磷酸酶及G6Pase，编码这些蛋白的基因在转录水平上被一些关键激素控制，特别是胰岛素、胰高血糖素和糖皮质激素。无论是在1型糖尿病还是2型糖尿病，肝糖输出过多是空腹高血糖和餐后高血糖的重要原因〔8〕。

　　Herzig等〔1〕研究揭示了空腹状态下CREB激活生糖基因的两步模式：空腹早期，针对儿茶酚胺和胰升糖素的刺激，CREB Ser133磷酸化，通过CREB介导的直接效应而诱导某些生糖基因(如PEPCK)的表达;若继续空腹，CREB通过诱导肝脏PGC1的表达进一步强化生糖基因(PEPCK、丙酮酸羧化酶和G6Pase)的表达，随后PGC1对糖皮质激素信号做出反应，介导糖异生过程的激活。

　　本研究中根据文献〔9〕及预实验，加入cAMP激动剂Forskolin作用于原代培养的大鼠肝脏细胞，可使CREB的磷酸化水平明显增高，而且PGC1α、PEPCK和G6Pase mRNA的表达也明显高于对照组，可见CREB是PGC1α的上游调节因子，其正常的生理作用对维持机体血糖稳定具有重要意义，提示磷酸化CREBPGC1α糖异生关键酶这一反应链在2型糖尿病的病理生理改变中发挥一定的作用，阻断它们之间作用的小分子化合物有可能作为降低2型糖尿病空腹血糖的有效辅助治疗手段。

　　【参考文献】

　　1 Herzig S，Long F，Jhala US,et al.CREB regulates Hepatic Gluconeogenesis via the Coactivator PGC1〔J〕.Nature,2001;413:17983.

　　2 Herzig S，Hedrick S，Morantte L,et al.CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPARgamma〔J〕.Nature，2003;426:1903.

　　3 Handschin C，Spiegelman BM.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator 1 coactivators，energy homeostasis，and metabolism〔J〕. Endocr Rev，2006;27(7):72835.

　　4 赵 媚,肖 琳,杨 琳，等.丙戊酸钠对培养大鼠肝细胞的毒性作用〔J〕.第四军医大学学报，2005;26(3)：22931.

　　5 Oetjen E，Lechleiter A，Blume R，et al.Inhibition of membrane depolarisationinduced transcriptional activity of cyclic AMP response element binding protein (CREB) by the dualleucinezipperbearing kinase in a pancreatic islet beta cell line〔J〕.Diabetologia，2006;49(2):33242.

　　6 赵文惠，萧建中，杨文英，等.肝脏胰岛素抵抗与肝糖输出调控基因表达的关系〔J〕.中华肝脏病杂志，2006;14：457.

　　7 Gonzalez GA,Yamamoto KK,Fischer WH,et al.A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMPregulated nuclear factor CREB predicted by its sequence〔J〕.Nature,1989;337:74952.

　　8 Yoon JC,Puigserver P,Chen G,et al.Control of hepatic gluconeogenesis through the transcriptional coactivator PGC1〔J〕.Nature,2001;413 (6852):1318.