2型糖尿病大鼠肝脏PGC1α、HNF4α基因的表达

　　作者：王晶 刘晓民 李艳波 周立红 张慧娟 作者单位：(哈尔滨医科大学第一临床医院内分泌科, 黑龙江 哈尔滨 150001)

　　【摘要】 目的 观察2型糖尿病(T2DM)大鼠肝脏过氧化物酶增殖体活化受体γ共激活剂(PGC)1α、肝细胞核因子(HNF)4α基因表达变化，并探讨其与T2DM糖代谢紊乱的关系。方法 取60只健康雄性Wistar大鼠随机分成T2DM组(40只)和正常对照组(20只)。以高脂高糖喂养加小剂量STZ腹腔注射法制备T2DM大鼠模型。8 w后，随机取两组大鼠各10只，心内取血检测生化指标，取肝脏，采用逆转录聚合酶链反应检测PGC1α、HNF4α基因表达水平。结果 与正常对照组大鼠相比，T2DM大鼠的空腹血糖(FPG)、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量明显增高(P<0.01)。HE染色显示T2DM大鼠肝脏出现组织学的改变，肝脏PGC1α(P<0.01)、HNF4α(P<0.05)基因表达水平明显增高。结论 T2DM大鼠肝脏PGC1α、HNF4α基因表达明显增强，提示二者的变化可能与T2DM的糖代谢紊乱有密切关系。

　　【关键词】 2型糖尿病;肝脏;PGC1α;HNF

　　【Abstract】 Objective To study changes of PPAR gamma coactivator (PGC)1α and hepatocyte nuclear factor (HNF)4α gene expression in liver of rats with type 2 diabetes mellitus (T2DM). Methods Totally 60 Wistar rats were randomly divided into T2DM (n=40) and normal control groups ( n=20 ). T2DM rat model was prepared with the method of high fat and high glucosefed plus lowdose STZ (30 mg/kg) injection. 8 w later, 10 rats were randomly selected in each group, and the blood sample was collected for measuring biochemical index. The liver tissues were obtained to analyze the expression of PGC1α and HNF4α gene with the method of reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Results Fasting plasma glucose (FPG) and serum triglyceride (TG), total cholesterol (TC) were higher in T2DM group than those in normal control group (P<0.01). HE stain showed the abnormal changes in livers of T2DM group. The mRNA level of PGC1α and HNF4α in liver was higher in T2DM group than those in normal control group (P<0.01 and P<0.05 respectively). Conclusions The increased expression of PGC1α and HNF4α gene in livers of T2DM rats may be highly correlated with abnormal hepatic glucose metabolism in individuals with T2DM.

　　【Key words】 Type 2 diabetes; Liver; PGC1α;HNF4α

　　肝脏是糖代谢的重要器官，肝糖输出异常增多是糖尿病代谢紊乱的重要特征。过氧化物增殖激活受体协同激活子(PGC1α、PGC1 或PPARGC1) 是近年来发现的一种转录协同激活子〔1〕,有研究表明〔2〕， PGC1α是糖异生过程的关键调节子,在肝细胞中过度表达可在转录水平上激活糖异生关键酶组,包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase),从而导致肝糖输出增加。　肝细胞核因子(HNF)4α是HNF家族中的重要成员,可在肝脏内高水平表达,参与肝脏糖、脂代谢相关基因特异性表达的调控〔3〕。PGC1α必须在协同激活其他因子如糖皮质激素受体、HNF4α、FoxO1 等情况下,才能诱导糖异生关键酶基因表达〔4,5〕 。本研究拟研究2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肝脏PGC1α、HNF4α基因表达情况，并探讨其与T2DM糖代谢紊乱的关系，为探讨糖尿病的发生机制和研制新的治疗方法提供新思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 健康雄性6周龄Wistar大鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(合格证号20020001)，体重140～160 g。

　　1.2 动物分组及T2DM大鼠模型建立 参照Reed的方法〔6〕，健康雄性Wistar大鼠适应性喂养3 d后，随机分成正常对照组(20只，普通饲料喂养)和T2DM组(40只，高糖高脂饲料喂养+STZ注射组, 即模型组),自由进食进水, 12 h光照周期。普通饲料由哈尔滨医科大学第一临床医院实验动物中心提供，高脂高糖饲料组成为普通饲料加20%炼猪油(市售)、10%蔗糖、1%胆固醇和0.25%胆酸盐(购自天津市博迪化工有限公司)。T2DM组大鼠给予高脂高糖喂养4 w后，一次性腹腔注射小剂量STZ(按30 mg/kg 体重剂量标准，STZ，Sigma，以0.001 mol/L柠檬酸钠缓冲液配成0.5%的溶液，pH4.2)，正常组大鼠腹腔注射等体积的柠檬酸钠缓冲液。第4天开始连续3 d，隔夜空腹血糖>12 mmol/L为T2DM模型成功，继续喂养4 w(每周测体重、血糖)后，取T2DM组成模大鼠和正常组大鼠各10只，隔夜空腹12～14 h，断尾采血血糖仪(美国强生)测血糖，1%苯戊巴比妥钠(50 mg/kg) 麻醉下剑突下心内取血，分离血清，用于生化指标的测定，取适量肝组织置于10%中性甲醛固定，供HE染色，另取部分肝组织置于液氮中留做基因的检测。

　　1.3 生化指标测定 断尾采血血糖仪(强生)测空腹血糖(FPG)，放免法检测空腹血清胰岛素(FINS，大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自美国Linco公司)，酶比色法测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的含量(试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司)。

　　1.4 逆转录聚合酶链反应(PTPCR)测定 肝脏总RNA的提取采用Trizol(美国Invitrogen公司)一步法，按说明书操作。逆转录合成单链cDNA后，进行聚合酶链反应(PCR)。PGC1α、HNF4α及内参照βactin基因的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列根据参考文献〔7,8〕设计如下：PGC1α上游引物，5′CGCACAACTCAGCAAGTCCTC3′;下游引物，5′CCTTGCTGGCCTCCAAAGTCTC3′; HNF4α上游引物，5′AGATGGCTTCCTGCTTGG3′;下游引物，5′TAGTTGCCAACACGATGC3′; βactin上游引物，5′GGGTCAGAAGGATTCCTATG3′; 下游引物，5′GGTCTCAAACATGATCTGGG3′。反应条件：94℃预变性5 min， 94℃变性30 s，56℃～58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环26～30次，72℃终末延伸5 min。三基因的退火温度和循环次数分别为：PGC1α 56℃，30个循环;HNF4α58℃，30个循环;βactin 56℃，26个循环。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统进行密度扫描，以βactin为内参照，计算PGC1α、HNF4α基因的相对表达量。

　　1.5 统计学分析 数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件进行组间t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠的一般情况、血清生化指标 实验结束时，T2DM组大鼠的体重(BW)、FPG、血清TG和TC含量明显高于正常对照组(P<0.01)，虽然T2DM组大鼠FINS略高于NC组，但差异不显著(P>0.05)，见表1。表1 两组大鼠的一般情况和生化指标比较与正常对照组比较：1) P<0.01

　　2.2 各组大鼠肝脏病理改变 与正常对照组大鼠比较，T2DM组大鼠肝脏体积明显增大，颜色呈土黄色，肉眼甚至可见肝被膜下脂肪沉积，HE染色光镜下显示肝细胞浆内可见小脂滴形成。

　　2.3 各组大鼠肝脏PGC1α、HNF4α基因mRNA表达水平的改变 T2DM组大鼠肝脏PGC1α、HNF4α基因mRNA表达量明显高于正常对照组(分别为P<0.01和P<0.05)，见表2。表2 两组大鼠肝脏PGC1α、HNF4α mRNA表达水平比较与正常对照组比较：1) P<0.01，2) P<0.05

　　3 讨 论

　　PGC1α最早作为调控脂肪细胞分化的核受体PPARγ的辅激活因子被发现，后来，其更多的下游靶转录因子及其在转录后的可能存在的调控作用不断被揭示。尤其是PGC1α在葡萄糖代谢和脂质代谢中的作用，已成为近几年研究的热点〔9〕。

　　PGC1α mRNA 在心脏中表达最高,其次是肌肉和肝脏,另外,在棕色脂肪、肾脏等有高能量需求或适应性产热作用的组织中表达水平相对较高,在大肠、小肠及白色脂肪组织(WAT)中表达水平低〔10〕。PGC1α可广泛调节能量生成与利用过程，如适应性产热、线粒体生物合成、肌肉中葡萄糖转运、骨骼肌纤维类型转换、脂肪酸β氧化,并是肝糖异生过程的关键调节因素,这些作用主要是通过协同激活多种因子来完成的〔11〕。 PGC1α 在生物体内复杂的生理调控作用以其特殊的分子结构特点为基础,参与其下游核受体控制的靶基因的转录起始、RNA 加工等环节的调控。而核受体及其调控的基因表达紊乱本身也是糖尿病及肥胖等病理过程的重要病因〔12〕。葡萄糖在机体内的摄取和产生环节分别在骨骼肌和肝脏中完成，PGC1α 在葡萄糖的摄取和代谢过程中的作用对于糖尿病的机制研究和治疗应用有特殊的意义。

　　Herzig 等〔13〕研究证明,空腹状态时,胰升糖素通过cAMP 途径激活蛋白激酶A(PKA)，使cAMP 反应元件结合蛋白(CREB) 磷酸化,后者与cAMP 反应元件(CRE) 结合,诱导PGC1α基因的表达。使用CREB显性失活突变株(a dominantnegative CREB mutant，ACREB),使CREB失去DNA结合活性的小鼠表现为空腹低血糖以及糖异生关键酶,包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、G6Pase表达降低。如果使这种小鼠过度表达PGC1α,则可使血糖平稳，糖异生关键酶表达恢复。Yoon 等〔2〕研究显示,肝脏胰岛素受体敲除的小鼠表现为肝糖输出不受胰岛素抑制,糖异生关键酶的水平增加,其PGC1α的水平增高。用腺病毒使Wistar 大鼠过度表达PGC1α 后表现为高血糖和高胰岛素血症。这些研究提示，PGC1α水平增加从而激活糖异生关键酶造成肝糖输出的增加在肝脏胰岛素抵抗和T2DM发生发展中发挥了重要作用。

　　HNF4α在肝脏高水平表达,调节肝脏内磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因特异性表达,对肝细胞代谢起着重要作用〔14〕。Yoon 等〔2〕研究还显示，PGC1α刺激肝脏糖异生依靠其与 HNF4α的直接接触,从而促进 PEPCK 等糖异生限速酶的转录起始,直接调节肝脏糖异生的效率。

　　本研究提示PGC1α与HNF4α基因的相互作用可能与T2DM糖代谢紊乱发生发展有密切关系。

　　由糖异生增强所导致的肝葡萄糖生成过多是糖尿病患者空腹血糖和餐后血糖过度升高的主要机制之一，抑制糖异生和肝糖输出一直是引人关注的糖尿病治疗手段。由于PGC1α生理作用广泛，在许多组织中都有表达，因而发现一种PGC1α肝选择性抑制因子即只抑制PGC1α在肝脏中的作用而不影响PGC1α在其他非糖异生组织中的作用,或研发针对PGC1αHNF4α复合物的抑制剂应成为糖尿病抗糖异生治疗的研究重点。例如，固醇调控元件结合蛋白(SREBP) 是一种调控脂质代谢的转录因子,它可以通过与PGC1α竞争HNF4α的结合位点,干扰PGC1α的募集,从而抑制糖异生〔15 〕 。此外，由于PGC1α对于脂质代谢也有一定作用〔16〕，可见，深入阐明PGC1α的精细代谢调节通路和机制,将关键的PGC1α作用环节作为治疗靶点将可能为控制T2DM对现代人类的危害提供新的思路。

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