虎杖免煎冲剂对糖尿病大鼠的肾脏保护的作用
发表时间：2010-08-16 浏览次数：467次
作者：肖正大 费洪华 刘宇 张荣花 张波 作者单位：山东大学附属济南市中心医院内分泌科,山东 济南 250013
【摘要】 目的 探讨虎杖免煎冲剂对实验性糖尿病大鼠肾脏病理结构和RAGE、VEGF表达的影响。方法 36只Wistar大鼠,8只普通饲料喂养,其余给予高糖高脂饲料喂养,4 w后注射链脲佐菌素造成糖尿病模型。造模成功后应分别用虎杖免煎冲剂(1.5 g·kg-1·d-1)、氨基胍(100 mg·kg-1·d-1)、蒸馏水灌胃。8 w后观察各生化指标的变化;HE染色及电镜下观察肾脏病理改变;免疫组化法检测肾小球糖基化终末产物受体(RAGE)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果 与模型组相比，虎杖组的肾重/体重、肌酐清除率、24 h尿蛋白量、肾小球平均体积均下降(P<0.01，P<0.05),肾脏病变程度轻，肾小球RAGE、VEGF表达下调(P<0.01)。结论 虎杖免煎冲剂对糖尿病大鼠具有肾脏保护作用，其机制可能与其下调肾组织中RAGE、VEGF的表达有关。
【关键词】 虎杖免煎冲剂 氨基胍 糖尿病肾病 糖基化终末产物受体 血管内皮生长因子
糖尿病肾病(diabetic nephmpathy，DN)病理学改变表现为肾脏肥大、肾小球和肾小管基底膜增厚，最后出现肾小球纤维化、硬化〔1〕。AGERAGE 系统〔2〕是DN的发生机制之一,AGEs与RAGE 的结合及相互作用，诱使许多细胞因子及生长因子的合成和释放，导致肾小球超滤过及持续血管扩张，造成DN 初期的高滤过、高灌注状态，对肾脏产生损害。很多单味中药对DN有保护作用，中药合剂虎杖免煎冲剂系临床治疗糖尿病的中药方,本文旨在研究其对糖尿病大鼠肾小球基底膜及肾皮质中RAGE、VEGF表达的影响，探讨其对肾脏保护的作用。
1 材料与方法
1.1 动物 雄性Wistar大鼠36只，体重130～150 g，由山东大学医学院实验动物中心提供,在恒温22℃、相对湿度65%～70%、光照周期12 h环境中适应性饲养1 w后进入实验。
1.2 动物饲料 普通饲料配方: 40%玉米面、26%白面、10%麸子、10%鱼粉、10%豆饼、2%矿物质、1%粗盐、1%复合维生素。高糖高脂饲料〔3〕配方:62%普通饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、0.5%胆酸盐、5%蛋黄粉。
1.3 药物与试剂 虎杖免煎冲剂(由虎杖、生黄芪、黄精、三七、丹参、仙灵牌、冬虫夏草组成，用药比例为2∶3∶4∶3∶4∶0.5∶9，饮片由江阴天江有限公司生产)。氨基胍(Sigma公司)。用前均用蒸馏水配至所需浓度的混悬液，4℃冰箱贮藏备用。链脲佐菌素(STZ)(Sigma公司)，用前溶于0.1 mol/L的无菌枸橼酸缓冲液中，pH 4.5。兔抗大鼠AGER多克隆抗体(Santa公司)、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体(北京博奥森公司)、链酶亲和素生物素复合物(SABC)(福建迈新生物技术有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 模型的建立 将36只雄性Wistar大鼠随机选取8只作为正常组(A组),给予普通饲料喂养;其余26只大鼠予高糖高脂饲料喂养4 w后，禁食12 h,按35 mg/kg体重STZ单次尾静脉注射;正常组注入等量无菌枸橼酸钠缓冲液。72h后尾静脉取血，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖～确定为糖尿病大鼠。造模期间有2只大鼠血糖值偏低，剔除。成模的24只大鼠按血糖值随机分为模型组(B组)，虎杖组(C组)，氨基胍组(D组)。成模后开始每日上午8～9时1次;虎杖组给予虎帐免煎冲剂按成人剂量的7倍，1.5 g·kg-1·d-1灌胃，氨基胍组给予氨基胍100 mg·kg-1·d-1灌胃，模型组和正常组给予等量蒸馏水,给药4 w。实验期间自由饮水,不使用胰岛素和其他降糖药。实验期间有2只大鼠死亡。
1.4.2 标本收集 大鼠处死前2 d进代谢笼，收集24 h尿液，离心分装后保存于-30℃ 冰箱中待测。大鼠禁食不禁水12 h,水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，腹部正中切口，上腔静脉穿刺取血，4℃离心取血浆保存于-20℃。肾脏经4℃预冷的生理盐水灌洗,至整个肾脏颜色变苍白后游离，去除包膜称重,将肾脏纵向对半剖开，置于10%中性福尔马林液浸泡固定，按梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。观察肾脏病理形态学改变。取1 mm大小的肾皮质组织经4%戊二醛固定，脱水，浸透，包埋，制成50 nm的超薄切片。醋酸铀及枸橼酸铅双染色后置于电镜下观察。
1.4.3 检测指标 空腹血糖(FPG)、血肌酐(SCr)、尿肌酐(UCr)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)均采用Hitachi7150型自动生化分析仪进行检测，24 h尿蛋白(24 hUP)采用EIA 进行检测，计算内生肌酐清除率(Ccr)，结果用体质量校正。
1.4.4 肾组织中RAGE、VEGF蛋白的表达 采用石蜡切片,用SABC法检测。切片厚度4 μm，常规脱蜡、封闭内源性过氧化酶，应用微波处理(98℃，15 min)修复抗原。分别加入1∶200兔抗大鼠RAGE多克隆抗体(一抗)、1∶400兔抗大鼠RAGE多克隆抗体(一抗)，均以PBS代替一抗作阴性对照;加生物素标记的羊抗兔IgG(二抗);加SABC复合物、DAB显色，镜下控制显色深度。苏木素复染，中性树胶封片。肾组织中的RAGE和VEGF的表达用HPIAS1000医学彩色图像分析系统进行免疫组化图像分析，经标准灰度校正后，随机取5个视野，测定RAGE、VEGF的平均积分光密度值( IDP)。
1.4.5 肾组织病理观察分析 HE染色,用HPIAS1000医学彩色图像分析系统,在200倍视野下每个标本测20个肾小球面积。肾小球体积(V) = 4πr3/3(π= 3.14，r为肾小球半径)。电镜观察肾小球滤过屏障情况，测定肾小球基底膜平均厚度。
1.5 统计学处理 所有数据用SPSS10.0统计软件处理。数据均以x±s表示，用OneWay ANOVA(单因素方差分析)方法，方差齐性用最小显著差法(LSD)检验，方差不齐用Tamhane′s t2检验。采用直线相关分析及线性回归分析。
2 结果
2.1 一般生化指标的变化 见表1。B、C、D组大鼠较A组大鼠的FPG、Ccr、肾重/体重(KW/BW)均显著升高(P<0.01，P<0.05);C、D组大鼠较B组大鼠Ccr、24 hUP、KW/BW均明显降低 (P<0.01，P<0.05);C组大鼠的FPG、BUN较B组大鼠明显降低(P<0.05);C组大鼠较D组大鼠的FPG、24 hUP降低(P<0.05)。
表1 各组大鼠FPG、TC、TG、Ccr、BUN、KW/BW、24 hUP的比较(略)
与A组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与B组比较：3)P<0.05，4)P<0.01;与D组比较：5)P<0.05;下表同
2.2 肾组织病理检查结果
2.2.1 光镜下检查结果 见表2。B、C、D组大鼠较A组大鼠系膜区基质增生，系膜区扩大;C、D组较B组基质增生减轻;B、C、D组大鼠肾小球体积均较A组明显增大(P<0.01)，C、D组均较B组明显减小(P<0.05)，C组较D组明显减小(P<0.05)。
2.2.2 电镜下检查结果 见图1、表2。电镜下A组大鼠足细胞体积较大，胞质内有丰富的粗面内质网和线粒体。足突细长,排列整齐，突起之间裂孔清晰，基膜厚度正常,均匀一致,屏障结构完整。B组大鼠肾小球足突融合明显，足细胞内细胞器部分消失，系膜基质增多，部分基底膜明显厚于正常组(P<0.01)，屏障结构破坏明显。而C、D组大鼠肾小球足突排列较整齐，裂孔明显，仅有少量足突融合，基底膜薄于B组(P<0.01)，厚于A组(P<0.01)，屏障结构较完整。C组基底膜薄于D组(P<0.05)。
图1 肾组织病理学观察结果(醋酸铀、枸橼酸铅双染色×20 000)(略)
表2 各组大鼠肾小球体积(GV)、基底膜厚度、RAGE、VEGF的比较(略)
图2 RAGE在肾小球的表达(×200)(略)
图3 VEGF在肾小球的表达(×200)(略)
2.3 肾组织RAGE、VEGF免疫组化染色 免疫组化染色后大鼠肾小球出现棕黄色物质为阳性，A组大鼠肾小球中均有少量RAGE表达,为弱阳性。B组大鼠肾小球中均有明显RAGE的表达,可见肾小球内皮细胞和系膜区内有大量棕黄色阳性染色，与A组相比，其染色阳性细胞数及染色深度明显增强，为强阳性。B、C组为阳性表达，见图2。VEGF的免疫组化染色特点与RAGE相类似，见图3。 免疫组化半定量分析结果，B、C、D组大鼠与A组相比,肾小球RAGE、VEGF的表达增强(P<0.01);C、D组大鼠肾小球RAGE、VEGF明显低于B组(P<0.01)，C组肾小球RAGE、VEGF明显低于D组(P<0.05，表2)。
2.4 相关分析及回归分析 模型组大鼠24 hUP与RAGE、VEGF、基底膜厚度呈正相关(r=0.776,P<0.05;r=0.799,P<0.01;r=0.800，P<0.01) 。线性多元逐步回归分析方程: 24 hUP =0.572RAGE + 0.281VEGF+1.496基底膜厚度,方程的检验有显著性水平(P<0.05)。模型组VEGF与RAGE呈正相关(r=0.743,P<0.05),回归方程为VEGF=4.998+0.907RAGE。
3 讨论
DN的发病机制较为复杂，Yamamoto 等在研究中发现AGERAGE系统的作用能增强氧化应激、激活NFκB信号途径,刺激产生一些细胞因子和生长因子,从而在糖尿病微血管病变中发挥作用〔4〕。DM大鼠肾脏RAGE表达的增加与高血糖引起的高级糖基化终末产物(AGEs)的形成和沉积有关，RAGE主要表达在肾脏的血管内皮细胞、单核巨噬细胞及足突细胞〔5〕;VEGF有强大的促进内皮细胞分裂、增殖、血管生成及增加血管通透性的细胞生长因子。高糖条件下,系膜细胞VEGF mRNA 表达显著增加〔6，7〕。
虎杖免煎冲剂由虎杖、冬虫夏草等7味单药组成，每味单药都有肾脏保护作用，分别有降血糖、降血脂、抑制血小板聚集、改善微循环、清除氧自由基、抑制醛糖还原酶活性、抑制AGEs生成等作用〔8〕。本研究结果显示,虎杖组的FPG、RAGE与VEGF表达量、基底膜平均厚度均显著低于模型组，表明虎杖免煎冲剂具有降糖作用，能使肾脏皮质RAGE与VEGF的表达下调，从而改善肾脏病理结构;虎杖免煎冲剂组大鼠的FPG、BUN、24 hUP、Ccr、KW/BW低于氨基胍组大鼠。虎杖免煎冲剂可能通过降血糖、抗氧化、抑制醛糖还原酶活性而抑制AGEs的形成，进而下调RAGE的过度表达。虎杖组较模型组VEGF表达量显著降低，可能是因为虎杖免煎冲剂减少了RAGE的生成，从而降低了AGERAGE相互作用，进而使VEGF的生成减少;或者直接通过抗氧化应激等其他途径抑制了VEGF的生成。
有研究表明〔9〕氨基胍为AGEs抑制剂，它能特异性抑制AGEs的形成，在试验性糖尿病模型中，减少肾脏AGEs的蓄积及基底膜的沉积物，阻断从Amadori产生到AGEs的转化，从而起到保护肾脏的作用。氨基胍还是特异性一氧化氮合酶抑制剂，从而阻止早期糖尿病肾病一氧化氮的过度合成，减轻肾小球内高压力、高灌注、高滤过，发挥保护肾脏的作用。本试验结果显示，氨基胍组RAGE、VEGF的表达及蛋白尿等较模型组降低，证实氨基胍具有肾脏保护作用。
综上所述，虎杖免煎冲剂对肾脏具有保护作用，其机制之一可能与其直接或间接抑制肾脏RAGE表达，进而减轻AGEsRAGE之间的相互作用，减少VEGF的生成，并改善肾脏病理结构有关，这为临床应用虎杖免煎冲剂治疗DN提供了依据。
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