HMG-CoA还原酶基因多态性对辛伐他汀调脂疗效的影响

　　作者：苏颖 孙延明 刘晓民 栾颖 王月影 作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院内分泌科一病房 哈尔滨医科大学附属第二医院心血管内科 黑龙江 哈尔滨 150001

　　【摘要】 目的 观察辛代他汀治疗2型糖尿病患者高脂血症的疗效及3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因第2内含子区ScrF1酶切位点多态性对调脂药物疗效的影响。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法测定144例健康对照者和168例2型糖尿病患者HMG-COA还原酶基因型，分析基因型与血脂水平和辛伐他汀调脂疗效的关系。结果 与aa基因型相比，2型糖尿病AA基因型患者具有较高的极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平(P<0.05);辛伐他汀治疗12 w后，AA基因型较Aa及aa基因型个体VLDL-C水平明显降低，与治疗前相比有显著性差异(P<0.05)。结论 HMG-COA还原酶基因多态性对VLDL-C水平有显著影响，该基因多态性可能成为辛伐他汀调脂疗效的预测因子。

　　【关键词】 基因多态性;血脂;辛伐他汀;2型糖尿病

　　基金项目：黑龙江省卫生厅资助课题(编号：2005-164);哈尔滨医科大学附属第一临床医学院科研基金资助课题(编号：2004-6)

　　脂代谢紊乱是2型糖尿病的重要发病机制之一。糖尿病及血脂异常的发生具有明显的遗传易感性。3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是内源性胆固醇合成的限速酶，它在调控胆固醇代谢中起重要作用〔1～4〕。由于HMG-CoA还原酶基因对脂质代谢起到重要作用，因此，HMG-CoA还原酶的基因突变目前已成为研究的热点之一〔5，6〕。近20年来，遗传药理学的研究发现药物作用位点的基因多态性是药物反应个体差异的重要原因。药物作用位点的基因变异可以引起表达的蛋白功能改变，导致机体对相同浓度药物反应性的改变。因此，当应用药物进行临床治疗时，应充分考虑药物作用位点基因变异所引起的药物反应差异。目前，国内外尚未见到有关HMG-CoA还原酶基因的多态性与2型糖尿病血脂异常关系的报道。本研究主要通过应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，研究2型糖尿病患者及正常人群中HMG-CoA还原酶基因多态性与2型糖尿病血脂代谢紊乱的关系及此基因对他汀类降脂药物临床疗效的影响。阐明降脂药物作用相关蛋白的遗传变异对2型糖尿病血脂治疗的影响，并从中找出药物作用位点基因多态性在2型糖尿病治疗的个体和群体差异的规律，为应用基因多态性理论实施个体化用药提供普遍的理论依据和规律性的临床应用原则。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象

　　168例(男91，女77)2型糖尿病患者，年龄56～73(平均63.37±10.25)岁，根据1999年WHO制定的标准诊断。144名(男87，女57)对照者，年龄53～75(平均62.37±9.83)岁，无糖尿病家族史，血糖检查正常，无其他内分泌疾病，以上受试者均取自我院住院及门诊无血缘关系北方汉族就诊者。低脂饮食1 w，血清总胆固醇(TC)>5.7 mmol/L及甘油三酯(TG)≥2.26 mmol/L者入选。

　　1.2 方法

　　1.2.1 仪器与试剂

　　PCR仪(Ependorf，德国);凝胶图像分析系统(珠海);低温冰柜(MDF-192，日本);低温高速离心机(Heraeus，德国);dNTPs，Taq DNA 聚合酶，PCR Marker(DL2000)为华美生物公司产品，限制性核酸内切酶ScrF 1购自gene公司，琼脂糖及其他试剂均为分析纯。

　　1.2.2 检测指标

　　患者服用辛伐他汀(商品名舒降之，德国默沙东公司产品)20 mg，每晚1次，连续服用12 w。服药期间仍维持低脂饮食。于服药前、服药后第12 w末分别空腹12 h抽血，血浆葡萄糖(FPG)浓度用葡萄糖氧化酶法测定;空腹胰岛素(INS)、C肽(C-Peptide)及糖化血红蛋白(HbA1C)用放免法测定;采用标准酶法测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)，用离心法测定血浆低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)按通用公式计算，即LDL=TC-(TG/2.2+HDL)mmol/L。

　　1.2.3 HMG-COA还原酶基因ScrF 1酶切位点变异分析

　　采集外周血，用常规苯酚/氯仿方法抽提基因组DNA。采用PCR-RFLP方法检测HMG-CoA还原酶基因的多态性。PCR扩增引物为5′-TACTGGTAACAATAAGATCTGTGGT-3′和5′-ATATTTTGATCCAAGTTGACGTAAA-3′。PCR反应体系：反应体积为25 μl，含100 ng模板DNA，dNTP各200 μmol/L，2.5 mmol/L MgCl2，引物各0.2 μmol/L，Tag 酶1.0 U。PCR程序：94℃预变性4 min后，开始以下循环：94℃变性30 s，65℃复性40 s，72°C延伸2 min，循环35周期后于72℃延伸10 min。取10 μl PCR产物，加限制性核酸内切酶ScrF 1 10 U于37℃酶切反应2 h后，酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳。紫外灯下观察结果，照像。AA基因型仅为165 bp 1条片段，Aa型可见165 bp和120 bp 2条片段，aa 型为120 bp 1条片段。

　　1.3 统计学处理

　　以Hardy-Weinberg平衡法检验各组基因频率的群体代表性。采用SAS统计软件进行资料分析。组间差异用t检验和方差分析。基因型率的差异用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 2型糖尿病组与对照组间基因型和等位基因频率分布比较

　　见表1。2型糖尿病组HMG-COA还原酶基因第2内含子ScrF1酶切位点上AA型、Aa型和aa型频率分别为：28.6%、52.4% 和19.0%，对照组分别为25.7%、52.8%和21.5%;2型糖尿病组A和a等位基因频率分别为54.8%和45.2%，对照组分别为52.1%和47.9%。两组HMG-CoA还原酶基因型和等位基因频率无显著性差异(P>0.05)。表1 正常对照组和2型糖尿病组HMG-CoA还原酶基因型及等位基因分布频率比较(略)

　　2.2 2型糖尿病组与对照组间生化指标的比较

　　见表2。2型糖尿病组与对照组间FPG、INS、C-P、HbA1C以及血脂等指标均有显著性差异(P<0.05)。表2 正常对照组与2型糖尿病组生化指标比较(略)

　　2.3 辛伐他汀治疗前后血脂水平的变化

　　见表3。20 mg辛代他汀治疗12 w后，与治疗前相比，TC、TG、LDL-C、VLDL-C显著降低(P<0.01);HDL-C水平明显升高(P<0.01)。表3 2型糖尿病组辛伐他汀治疗前后血脂水平的比较(略)

　　2.4 HMG-CoA还原酶基因多态性与辛伐他汀药物疗效的关系

　　见表4。辛伐他汀治疗前，与aa基因型相比，AA基因型具有较高的VLDL-C(P<0.05);而血清TG、TC、LDL-C和HDL-C水平在三组之间无显著性差异(P>0.05)。辛代他汀治疗12 w后，比较不同ScrF1基因型个体血脂水平的变化，AA基因型较Aa及aa基因型个体VLDL-C水平降低显著(P<0.05)。表4 2型糖尿病组HMG-CoA还原酶各基因型血脂水平变化的比较(略)

　　3 讨 论

　　糖尿病是一种常见的多种基因和环境因素共同作用引起的综合征，2型糖尿病患者糖代谢紊乱和胰岛素的不适当分泌使内源性和外源性TG清除减弱，血中TG浓度增加，并伴有高胆固醇血症。高脂血症和脂质过氧化状态的增强与2型糖尿病患者的心脑血管及微血管并发症的发生、发展有一定的关系，因此，降低高脂血症和脂质过氧化过强的糖尿病患者的TC、TG、LDL、VLDL水平对防治其慢性并发症具有重要意义。

　　HMG-CoA还原酶基因定位于染色体5q13，该基因长约25 kb，由20个外显子和19个内含子组成。HMG-CoA还原酶抑制剂通过增加肝内LDL受体的合成和减少VLDL的生成，来降低TG水平。目前，关于HMG-CoA还原酶基因多态性的研究已有一些报道：如HMG-CoA还原酶基因2725A/G和3089T/C位点多态性与血浆血脂的关系〔6〕。本研究仅对2型糖尿病患者HMG-CoA还原酶基因第2内含子ScrF1 酶切位点多态性与辛伐他汀调脂疗效的关系进行了初步观察。本研究表明，2型糖尿病患者HMG-CoA还原酶基因第2内含子ScrF1酶切多态性影响血脂水平及辛伐他汀调脂的疗效，表现为辛伐他汀治疗前，与aa基因型相比，AA基因型具有较高的VLDL-C(P<0.05)，而辛伐他汀治疗12 w后，发现AA基因型较Aa和aa基因型个体VLDL-C水平降低显著(P<0.05)。

　　2型糖尿病患者HMG-CoA还原酶基因第2内含子ScrF1 酶切位点多态性与辛伐他汀调脂疗效的影响相关的可能机制有：(1)HMG-CoA还原酶基因直接参与脂肪代谢;HMG-CoA还原酶作为胆固醇合成的限速酶参与胆固醇代谢，对于维持细胞胆固醇动态平衡起重要作用，通过反馈机制它也间接对血清脂蛋白代谢起调节作用;(2)HMG-CoA还原酶基因第2内含子ScrF1 酶切位点附近可能存在一个影响脂代谢的基因的功能突变，两者存在连锁不平衡;(3)虽然此多态性位于非编码结构的内含子，但它邻近外显子，有可能会影响mRNA的剪切过程而导致HMG-CoA还原酶基因的异常，从而影响脂肪代谢。

　　总之，参与脂质代谢的HMG-CoA还原酶基因多态性影响降脂药物治疗高脂血症的疗效，随着对HMG-CoA还原酶基因多态性的深入研究，必将为糖尿病高脂血症患者的个体化治疗提供有益指标。

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