二甲双胍和吡格列酮对糖尿病大鼠胃组织胃促生长素表达的影响

　　作者：李健 王文汇 崔莹 娄宁 作者单位：山东大学附属济南市中心医院内分泌科，山东 济南 250013

　　【摘要】目的 探讨2型糖尿病大鼠分别用二甲双胍和吡格列酮治疗后血浆和胃组织胃促生长素(ghrelin)水平的变化及其与胰岛素敏感性的关系。方法 38只清洁级雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=7)、糖尿病对照组(n=9)、二甲双胍治疗组(n=9)、吡格列酮治疗组(n=9)。高糖高脂饮食加小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,成模大鼠分别给予生理盐水、二甲双胍和吡格列酮干预8 w，酶联免疫法检测血浆ghrelin水平，免疫组织化学法检测胃组织中ghrelin的表达水平。结果 二甲双胍组和吡格列酮组血浆及胃组织中ghrelin水平较糖尿病对照组均显著升高(均P<0.01)。相关分析显示：糖尿病对照组、二甲双胍组及吡格列酮组血浆ghrelin与空腹胰岛素呈负相关，与胰岛素敏感性(ISI)呈正相关。结论 二甲双胍和吡格列酮可升高2型糖尿病大鼠血浆及胃组织中ghrelin水平，改善胰岛素抵抗。

　　【关键词】 Ghrelin 2型糖尿病 胰岛素敏感性

　　胃促生长素(ghrelin)是近年来新发现的一种主要由胃黏膜分泌的脑肠肽，除刺激生长激素分泌外，还与能量代谢密切相关，可以促进进食和体脂增加〔1〕。明确ghrelin的生理作用以及与肥胖、糖尿病等胰岛素抵抗状态的关系，对于其临床应用很有意义。本研究旨在观察二甲双胍和吡格列酮治疗对2型糖尿病大鼠胃组织中ghrelin水平的影响，以探讨ghrelin与胰岛素敏感性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠38只(SPF级，批号SCKX鲁20050015)，6周龄，体重(180±20)g(山东大学实验动物中心提供)。随机分为正常对照组7只，喂以标准饲料;实验组31只，喂以高糖高脂饲料。8 w后，实验组大鼠空腹尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，48 h后尾静脉采血测血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠为2型糖尿病模型。将27只成模大鼠随机分为糖尿病对照组9只;二甲双胍治疗组9只，给予盐酸二甲双胍(格华止，中美上海施贵宝制药有限公司提供)200 mg·kg-1·d-1溶于蒸馏水中灌胃;吡格列酮治疗组9只，给予盐酸吡格列酮胶囊(顿灵，山东淄博新达制药有限公司提供)20 mg·kg-1·d-1溶于蒸馏水中灌胃;正常对照组和糖尿病对照组给予等量蒸馏水。干预8 w。实验结束时，剔除二甲双胍组死亡大鼠1只，吡格列酮组2只，余大鼠秤重，腹腔麻醉，下腔静脉取血2 ml，其中1 ml中加入含有乙二胺四乙酸(EDTA)1 mg、抑肽酶70 μg的试管内，分离血浆，-20℃放置。取胃组织生理盐水冲洗后置于10%福尔马林液中固定备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 生化指标检测 空腹血糖(FPG)测定用葡萄糖氧化酶法;空腹甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)由日立7180型全自动生化分析仪测定;空腹血浆胰岛素(FINS)测定用胰岛素放免试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司)。

　　1.2.2 血浆和胃组织中ghrelin含量测定 用酶联免疫法(EIA)测定，试剂盒由美国凤凰公司生产，批内变异系数<5%。

　　1.2.3 免疫组织化学法 采用链霉素抗生物蛋白过氧化物酶连结法(SP法)。一抗为兔抗鼠ghrelin多克隆抗体(美国凤凰公司生产)。Ghrelin免疫组化染色阳性反应细胞为定位于胃底泌酸腺颈部和基底部的X/A样细胞，为棕褐色高密度颗粒状圆环样细胞，呈散在分布。采用病理图像分析系统(4.1版)，对免疫组化图像进行灰度测量，通过计算细胞的积分光密度，反映ghrelin免疫组化染色情况。

　　1.2.4 胰岛素敏感指数 采用李光伟胰岛素敏感指数(ISI)法〔2〕，ISI=Ln〔1/(FBG(mmol/L)×FINS(mIU/L)〕。

　　1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理，检测数据以x±s表示，各组间指标比较采用方差分析，相关分析使用Pearson相关分析和多元线性回归分析。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠生化指标的比较 见表1。与正常对照组比较，糖尿病对照组大鼠体重、FPG、FINS、TC、TG及LDLC均明显升高(均P<0.01)，ISI及HDLC明显下降(均P<0.01);吡格列酮组与糖尿病对照组比较，大鼠体重、FPG、FINS、TC、TG及LDLC均明显下降(P<0.05或P<0.01)，ISI及HDLC明显升高(均P<0.01);吡格列酮组与糖尿病对照组比较，大鼠FPG、FINS、TG和LDLC均明显下降(P<0.05或P<0.01)，ISI和HDLC明显升高(均P<0.01)。

　　2.2 各组大鼠血浆及胃组织中ghrelin水平比较 糖尿病对照组与正常对照组比较，血浆和胃组织中ghrelin含量明显降低(P<0.01);二甲双胍和吡格列酮治疗后ghrelin明显升高(均P<0.01)，但仍低于正常对照组(均P<0.05)(表2)。

　　免疫组化染色显示，ghrelin阳性细胞呈棕褐色高密度颗粒状圆环样细胞，散在分布于胃底泌酸腺颈部和基底部，在糖尿病对照组表达明显减少;二甲双胍和吡格列酮治疗后增多(图1)。积分光密度值结果与血浆ghrelin表达变化一致。

　　表1 各组大鼠生化指标的比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与糖尿病对照组比较：3)P<0.05,4)P<0.01

　　表2 各组大鼠血浆及胃组织中ghrelin水平的比较(略)

　　与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与糖尿病对照组比较：3)P<0.01

　　图1 各组大鼠胃部ghrelin表达(SP法，×100)(略)

　　2.3 血浆ghrelin与血生化指标的相关分析 相关分析显示，糖尿病对照组血浆ghrelin水平与FPG、FINS含量呈显著负相关(P<0.05，P<0.01)，与ISI呈显著正相关(P=0.01);二甲双胍组和吡格列酮组ghrelin与FINS呈负相关(P<0.05，P<0.01)，与ISI呈正相关(P<0.05)。多元线性回归分析显示：FINS和ISI是糖尿病对照组、二甲双胍和吡格列酮治疗组血浆ghrelin的独立相关因素。

　　3 讨论

　　研究表明，ghrelin水平低者，存在较明显的胰岛素抵抗、较高的空腹胰岛素水平以及较高的2型糖尿病发病率〔3，4〕。2型糖尿病患者ghrelin水平低于非糖尿病患者，且与胰岛素水平呈负相关，与ISI呈正相关〔3〕。McLaughlin等〔5〕研究发现，胰岛素抵抗的肥胖患者血浆ghrelin水平显著低于胰岛素敏感的肥胖患者。

　　本研究显示，糖尿病对照组大鼠血浆及胃组织中ghrelin水平明显降低,且血浆ghrelin含量与空腹胰岛素呈负相关，与ISI呈正相关;FINS和ISI可引入回归方程，表明ghrelin与FINS和胰岛素抵抗独立相关，低ghrelin水平和(或)低ghrelin水平引起的生长激素作用减弱均可导致胰岛素敏感性的降低〔6〕。二甲双胍治疗后，胰岛素敏感性及血浆和胃组织中ghrelin水平升高，与Schofl等〔7〕用二甲双胍治疗肥胖的多囊卵巢综合征(PCOS)妇女后，血浆ghrelin水平增高一致。考虑机制为二甲双胍干预后，空腹胰岛素水平下降，解除了对血浆ghrelin的抑制作用。而Pagotto等〔8〕的研究却显示二甲双胍治疗对PCOS患者的血浆ghrelin水平无影响。具体机制有待进一步研究。吡格列酮治疗后，大鼠胰岛素敏感性及血浆和胃组织中ghrelin水平明显升高，而Otto等〔9〕用吡格列酮治疗2型糖尿病患者后，血浆ghrelin水平较治疗前未有显著改变。可能与Otto等的研究中，糖尿病患者治疗后的体重较治疗前显著增加，导致ghrelin未升高;而本研究大鼠的体重较糖尿病对照组没有明显升高有关。体外研究表明〔10〕，ghrelin治疗可显著增加原代培养大鼠分化的脂肪细胞过氧化物酶体增殖受体γ2(PPARγ2)mRNA的表达，噻唑烷二酮类药物激活PPARγ2增加胰岛素敏感性，ghrelin在体内是否也对PPAR-γ2起作用，从而起到辅助该药作用，对邓需要更深入的研究。

　　【参考文献】

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　　5 McLaughlin T,Abbasi F，Lamendola C,et al.Plasma ghrelin concentrations are decreased in insulinresistant obses adults relative to equally obese insulinsensitive controls〔J〕.J Clin Endocrin Metab,2004;89(4):16305.

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