褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响

　　作者：舒毅 作者单位：东南大学附属中大医院 内分泌科，江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：探讨褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响。 方法：对四氧嘧啶诱导糖尿病模型大鼠给予褪黑素和维生素E治疗14 d后，检测各组大鼠肾功能及肾脏氧化应激相关指标的变化。 结果：与糖尿病组大鼠相比，褪黑素治疗组肾质量、肾质量/体质量、血清尿素氮显著下降，血清肌酐无明显变化，而维生素E治疗组上述指标均无明显下降。褪黑素和维生素E可明显增加肾脏超氧化物歧化酶(SOD)活性，升高的谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性有所恢复，降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，褪黑素组与维生素E组相比差异显著。结论：氧化应激在早期糖尿病大鼠肾脏损害过程中起了重要作用，褪黑素通过增加糖尿病大鼠肾组织抗氧化能力，抑制肾组织氧化应激，对糖尿病肾脏起保护作用，褪黑素抗氧化能力明显强于维生素E。

　　【关键词】 糖尿病 肾 褪黑素 维生素E 氧化应激 大鼠 SparagueDawley

　　糖尿病肾病是糖尿病严重的并发症之一，其发病机制尚未完全阐明。近年来研究证明，在糖尿病持续高糖状态下，氧自由基生成增多，抗氧化防御能力下降，产生氧化应激，在糖尿病肾病发生、发展中起重要作用[1]。目前临床上除了可有效地控制高血糖外，尚未能最终控制糖尿病肾病的发生发展。因此,探索有效抑制氧化应激的干预措施具有重要的理论意义和临床应用价值。维生素E为存在于细胞膜的主要脂溶性抗氧化剂[2];褪黑素(melatonin, MLT)是松果腺合成与分泌的主要激素之一，它又是一具有强有力抗氧化作用的自由基清除剂[3]。本研究采用维生素E和褪黑素治疗早期四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠，旨在探讨抗氧化剂保护糖尿病大鼠肾脏病变的具体机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠38只,由东南大学实验动物中心提供，体质量170 210 g，2 3月龄，分笼饲养，实验动物室温度(22±2)℃，相对湿度(50±5)%，光照/黑暗12 h交替(06：00开灯，18：00关灯)，环境安静，予普通饲料和清洁饮水。

　　1.1.2 药物及主要试剂 褪黑素、维生素E和四氧嘧啶购自Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、葡萄糖测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组及处理 大鼠适应性饲养3 d后随机分为正常对照(NC)组(8只)和糖尿病(DM)组(30只)。糖尿病组大鼠予四氧嘧啶(临用前以生理盐水避光低温新鲜配制，质量浓度为40 g·L-1)200 mg·kg-1的剂量腹腔注射，3 d后尾静脉采血测定血糖，以血糖大于16.8 mmol·L-1确定为糖尿病模型，其中有24只大鼠成为糖尿病模型。糖尿病模型随机分为3组，每组8只：糖尿病对照(DMC)组;褪黑素治疗(DM+M)组，予褪黑素2 mg·kg-1腹腔注射;维生素E治疗(DM+E)组，予维生素E 100 mg·kg-1腹腔注射。维生素E和褪黑素溶于含10%乙醇的生理盐水，正常对照组和糖尿病对照组大鼠予等体积(2 ml·kg -1)含10%乙醇的生理盐水腹腔注射。每日17:00给药，持续给药14 d后处死。在实验过程中，DMC 和DM+E组各有1只大鼠死亡。

　　1.2.2 标本收集 处死前大鼠禁食12 h，称取体质量，用1.5% 戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，剖开胸腹腔，心脏穿刺采血，分离血清，测定血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。迅速取出双肾，去包膜后称质量，取肾皮质0.4 g在生理盐水冰浴下制成10%的组织匀浆，-70 ℃冻存待测MDA、NO含量和SOD、GSHPx活性。

　　1.2.3 观测指标及检测方法 体质量：每周1次;饮水量：实验第7、8天，连续2 d记录每只大鼠的饮水量，取其平均值作为最终数据;肾脏湿质量：去包膜后用精密天平称质量;血清血糖：葡萄糖氧化酶法;TG、TC、BUN和Cr：美国BECKMAN公司全自动生化分析仪检测，TG和TC用酶法，BUN用电极法，Cr用苦味酸法;MDA、NO含量和SOD、GSHPx活性：采用比色法，操作严格按试剂盒说明书进行;匀浆组织蛋白浓度：采用考马斯亮蓝法。

　　1.3 统计学处理

　　数据以x-±s表示，应用统计软件SPSS 12.0行方差分析，组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠一般情况及糖、脂代谢的影响 实验中DMC、DM+M和DM+E组的动物死亡率分别为12.5%、0和12.5%。与NC组大鼠相比，DM组大鼠出现显著的多饮和体质量减轻的症状(P< 0.01);与DMC组大鼠比较，DM+M和DM+E组大鼠体质量下降有所改善，饮水量略有降低 ，以DM+M组为甚，但差异无统计学意义;DM组大鼠血糖较NC组明显升高(P<0.01)，DM+M、DM+E和DMC组组间血糖相比差异无统计学意义;DMC组大鼠血清TC和TG组水平均明显上升，与NC组相比差异有统计学意义(P<0.01)。与DMC组相比，DM+M和DM+E组 TC和TG明显下降(均P<0.05)，DM+M组与DM+E组相比差异无统计学意义。见表1。

　　2.2 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾功能的影响 与NC组大鼠相比，DMC组大鼠肾质量、肾质量/体质量明显增加(P<0.05, P<0.01)，血清BUN和Cr显著升高(P<0.05, P<0.01);DM+M组上述肾功能指标均有不同程度下降，与DMC组相比，肾质量、肾质量/体质量和BUN有显著性下降(分别为P<0.05、P<0.01及 P<0.05);DM+E组肾质量、肾质量/体质量有所下降，但与DMC相比无显著性差异，BUN、Cr水平则无明显改变(均P >0.05);DM+M组BUN与DM+E组相比有显著性下降( P<0.05)。表明褪黑素对早期四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠有一定的肾保护作用，而维生素E无明显作用。见表2。表1 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠一般情况及糖、脂代谢的影响(表2 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾功能的影响与NC组比较，1)P<0.05，2)P <0.01;与DMC组比较，3)P <0.05，4)P<0.01;与DM+M组比较，5)P<0.05

　　2.3 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响 DMC组大鼠肾脏SOD活性明显下降，GSHPx活性、NO和MDA水平显著增加，与NC组相比差异有显著性(均P<0.01);与NC组比较，DM+M组SOD活性增加(P<0.05)，GSHPx活性和MDA恢复到正常水平(P>0.05)，DM+E组SOD活性增加到正常水平(P>0.05)，GSHPx活性和MDA水平有所下降但与NC组相比仍有显著性差异(P<0.01);与DMC组比较，DM+E组SOD活性增加(P<0.01)，GSHPx活性、NO和MDA水平下降(P<0.05, P<0.01, P<0.01)。褪黑素对糖尿病大鼠肾脏氧化应激的改善优于维生素E，DM+M组与DM+E组相比，SOD活性显著增加(P<0.05)，GSHPx活性、MDA水平显著下降(均P<0.01)，NO水平有所下降，但差异无统计学意义。见表3。 表3 褪黑素和维生素E对早期糖尿病大鼠肾脏氧化应激的影响

　　3 讨 论

　　大量研究结果表明糖尿病情况下存在明显的氧化应激，肾组织氧供丰富，活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生较多，同时肾组织中抗氧化酶发生糖化或氧化，使肾组织抗氧化能力明显降低造成氧化应激状态[3]。

　　本研究显示，在四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠成模2周后，大鼠出现了明显的糖脂代谢异常，肾质量、肾质量/体质量增加，血清BUN、Cr升高，说明模型大鼠出现了糖尿病和糖尿病早期肾脏病变。糖尿病模型大鼠肾组织氧化应激脂质过氧化产物MDA含量显著升高，SOD活性显著降低，可能与高血糖非酶糖基化作用以及清除组织中过量的超氧阴离子(O2-·)大量消耗SOD等因素有关[4]。关于糖尿病大鼠肾组织GSHPx活性变化的报道颇不一致[1,34]。本研究显示，糖尿病模型大鼠肾组织GSHPx活性明显上升，可能是由于SOD催化O2-·的歧化反应产生大量的过氧化氢(H2O2)，加上糖尿病时胰岛素作用不足，血糖不能被很好地利用，通过脂肪酸β氧化等途径导致H2O2的生成增加，引起GSHPx水平代偿性的升高，以清除过多的H2O2[5]。较多资料显示，糖尿病时NO的变化是一个随病程改变的过程，即早期NO合成增加而晚期合成减少。本研究显示糖尿病模型大鼠肾组织NO含量增加，支持糖尿病早期NO升高这一观点，这与糖尿病早期肾组织内皮型NO合酶(eNOS)表达水平上调而导致NO生成增加有关。

　　褪黑素是哺乳动物松果腺合成与分泌的主要激素之一。近年来的研究显示，褪黑素还有抗氧化作用。褪黑素具有脂溶性和水溶性，很容易进入细胞和亚细胞器，可直接淬灭ROS，能保护细胞核DNA、膜脂质、胞浆蛋白等生物大分子免受氧化损伤，褪黑素同时使SOD、GSHPx等抗氧化酶的生成增加和活性增强，这加强了褪黑素的抗氧化效应[3];褪黑素可抑制NOS活性，减少NO生成[4]，这提示褪黑素具一定肾保护作用。褪黑素对糖尿病大鼠有降低血糖、调节脂代谢的作用[6]。维生素E是体内最重要的抗氧化剂，可以及时终止自由基链反应，抑制膜脂质过氧化反应，稳定生物膜的结构与功能，保护糖尿病患者免受自由基的损害[2]。

　　本研究中，褪黑素和维生素E对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠进行干预实验后，肾组织SOD活性显著升高，GSHPx活性有所恢复，NO含量明显下降，抑制了脂质过氧化的发生，MDA水平显著降低，表明褪黑素和维生素E有显著的抗氧应激作用，两组相比褪黑素抗氧化能力明显强于维生素E。钟历勇等[6]研究发现在四氧嘧啶诱导糖尿病前1周即开始给予褪黑素治疗5周，可使糖尿病大鼠血糖水平降低。本研究褪黑素和维生素E为四氧嘧啶诱导糖尿病后给药，均未发现明显降低血糖作用，也可能与干预时间较短有关。褪黑素和维生素E使脂代谢紊乱的改善较为明显，血清TC、TG水平明显下降，但两组相比差异无统计学意义。褪黑素治疗组大鼠肾质量、肾质量/体质量、BUN显著下降，血清Cr无明显变化，而维生素E治疗组上述指标均无明显下降，显示了褪黑素对四氧嘧啶糖尿病大鼠肾脏的保护作用，而维生素E似乎无此作用。维生素E 对肾脏无保护作用，也可能与干预时间较短有关。同时，褪黑素对脂代谢紊乱的改善与维生素E组相比差异无统计学意义，而褪黑素抗氧化能力明显强于维生素E。

　　根据以上结果，可认为，氧化应激在糖尿病大鼠肾脏损害过程中起了重要作用，褪黑素通过增加糖尿病大鼠肾组织抗氧化能力，抑制肾组织氧化应激，对糖尿病肾脏起保护作用，并且褪黑素抗氧化能力明显强于维生素E。因此，褪黑素可作为一种新型的抗氧化剂，为糖尿病慢性并发症的临床防治提供一个新的策略。

　　【参考文献】

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　　[4]舒毅, 钟历勇, 石立. 褪黑素、维生素E和还原型谷胱甘肽对四氧嘧啶糖尿病大鼠氧化应激影响的比较研究[J]. 东南大学学报：医学版, 2006, 25(2): 8892.

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　　[6]钟历勇, 金晖, 高峰,等. 褪黑素抑制四氧嘧啶糖尿病大鼠垂体肾上腺轴功能[J]. 中华内分泌代谢杂志, 2003, 19(2):141142.