二甲双胍、罗格列酮对静脉输注脂肪乳大鼠胰岛素抵抗的影响

　　作者：潘作东 卢雁 何冰 张咏言 韩萍 作者单位：中国医科大学附属第二医院老年病科,辽宁 沈阳 110004

　　【摘要】 目的 观察不同药物干预对大鼠静脉输注脂肪乳造成胰岛素抵抗(IR)的影响。方法 给大鼠静脉输注脂肪乳(多不饱和脂肪酸)+肝素(NC)7 h,并在输注的最后2 h，行清醒状态高胰岛素正血糖钳夹实验，测定血浆葡萄糖、游离脂肪酸(FFA)、胰岛素和脂联素水平，观察脂肪酸对胰岛素介导的葡萄糖利用(GU)和肝葡萄糖生成(HGP)能力的影响，及罗格列酮3 mg/kg·d-1或二甲双胍300 mg/kg·d-1提前灌胃的保护作用。胰岛素敏感性用正常血糖高胰岛素钳夹技术稳态时的葡萄糖输注率(GIR)来评价。结果 在基础输注状态，与生理盐水组比较，脂肪乳组FFA增加0.5～1.7倍(P<0.01)，血糖轻度增高(P<0.01)，胰岛素增加0.8倍、脂联素则有所下降(P<0.01)。在高胰岛素钳夹实验中，脂肪乳组比生理盐水组FFA增加了2～3倍(P<0.01);HGP增加了1.2倍(P<0.01);但低于基础状态的FFA。生理盐水组GU比其相应基础状态增加了3.3倍(P<0.01);与生理盐水组比较，脂肪乳组GU降低，差异有统计学意义(P<0.01)。各组稳态输入胰岛素水平相同，维持相同的稳态血糖所需的GIR，与生理盐水组比较，脂肪乳组GIR明显下降达51.3%(P<0.01)。与脂肪乳组比较，二甲双胍组GIR增加了58.9%(P<0.01)。罗格列酮组GIR增加了149.6%(P<0.01)，且高于对照组。结论 血浆脂肪酸短期升高能引起大鼠肝脏和外周胰岛素抵抗。罗格列酮和二甲双胍均可显著改善血浆脂肪酸短期升高引发的胰岛素抵抗。

　　【关键词】 脂肪酸;胰岛素抵抗;肝葡萄糖生成;葡萄糖利用

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与药品

　　选用健康雌性Wistar(由中国医科大学第二医院 实验动物中心提供 合格证号：SYXK(辽)20030019)大鼠48只，体重250～300 g，明/暗周期各为12 h，基础饲料喂养，随意进食和饮水。血浆血糖(BIOSEN5030，德国)，C肽(北京福瑞生物工程公司)。血浆FFA，20%脂肪乳(华瑞公司)。罗格列酮(商品名文迪雅,葛兰素史克公司，二甲双胍(商品名格华止,施贵宝公司)，基因重组人胰岛素(商品名优泌林R,美国礼来公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 建模

　　所有大鼠适应实验室环境3～5 d后，用氯胺酮∶甲苯噻嗪∶乙酞丙嗪(100∶0.1∶0.5，按体重1 pl/g)麻醉，将聚乙烯导管2根，每根一端接有一段3 cm长的硅胶管(内径0.02英寸)分别植人右颈内静脉用于输液和左颈动脉用于采血，静脉导管置于右心房水平，动脉导管置于主动脉弓水平，2根导管均经皮下颈背部引出。大鼠术后恢复3～4 d后，进行清醒状态下脂肪输注和高胰岛素正血糖钳夹试验〔1〕。大鼠存活并适应插管状态为建模成功。

　　1.2.2 分组及给药

　　所有大鼠隔夜禁食14 h，以随机数字表法分为4组，每组12只，分别为生理盐水组(对照组)、脂肪乳组、二甲双胍组和噻唑烷二酮组。以后简称为NC、IH、Met、Ros组。Ros组、Met组大鼠提前3 d每天分别给予罗格列酮3 mg·kg-1·d-1或二甲双胍300 mg·kg-1·d-1进行灌胃。3 d后NC组大鼠从颈内静脉输液生理盐水，IH、Met、Ros组输液脂肪乳(20%脂肪乳+20 IU/ml肝素)，输液速度均为5.5 μl/min。各组持续静脉输注相应液体7 h，在输注的后2 h，各组同时输注同位素标记的葡萄糖(首剂6〔3H〕葡萄糖20 μCi静脉推注，继以0.4 μCi/min静脉输注)，以评价肝糖生成(HGP)。

　　同时各组再随机平均分为持续空腹基础输注组和清醒状态高胰岛素正血糖钳夹组。清醒状态高胰岛素正血糖钳夹组在输注原液体的同时输注胰岛素(5 mU·kg-1·min-1)和20%葡萄糖，并每5 min抽取动脉血测葡萄糖1次，根据血糖值调整输液速度，以维持正常血糖浓度。所有实验组均在试验的最后30 min，每10 min采动脉血1次，备测葡萄糖、胰岛素、FFA、C肽和6〔3H〕葡萄糖前射活性。

　　1.2.3 测量指标

　　采用葡萄糖氧化酶法测定血浆血糖(BIOSEN5030，德国)。用Ba(OH)2和ZnSO4脱蛋白，离子柱交换，干燥后测定6〔3H〕葡萄糖的放射活性〔2〕。放射免疫法(RIA )测定胰岛素(北京福瑞生物工程公司)。采用比色法测定血浆FFA(南京建成生物工程研究所)。用稳态公式计算6〔3H〕葡萄糖出现率(glucose appearance rate)〔3〕。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS 12.0软件，数据以x±s表示，对于持续空腹基础输注和清醒状态高胰岛素正血糖钳夹实验的重复数据采用单向方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 脂肪乳对大鼠血浆FFA、葡萄糖、胰岛素和脂联素的影响

　　在基础输注状态，与NC组比较，IH组FFA增加0.5～1.7倍(P<0.01)，血糖轻度增高(P<0.01)，胰岛素增加0.8倍、脂联素则有所下降(P<0.01)。在高胰岛素钳夹实验中，IH组比NC组FFA增加了2～3倍(P< 0.01)，但低于基础输注状态的FFA(见表1)。表1 基础输注状态下脂肪乳对大鼠血浆FFA、葡萄糖、胰岛素和脂联素水平的影响(略)

　　2.2 脂肪乳对HGP和葡萄糖利用(GU)的影响

　　在基础输注状态，脂肪乳输注使HGP增加，约为NC组的1.5倍(P<0.01)。在高胰岛素正血糖钳夹状态，IH组HGP明显高于NC组，增加了1.2倍(P<0.01)。在基础输注状态，HGP等于GU，脂肪乳增加了基础状态GU，大约为NC组的1.5倍(P<0.01)。在高胰岛素正血糖钳夹状态，NC组GU比其相应基础状态增加了3.3倍(P<0.01);与NC组比较，IH组GU降低，差异有统计学意义(P<0.01)。各组稳态输入胰岛素水平相同,维持相同的稳态血糖所需的葡萄糖输注率(GIR),与NC组比较,IH组GIR明显下降达51.3%(P<0.01)。与IH组比较,Met组GIR增加了58.9%(P<0.01)。Ros组GIR增加了149.6%(P<0.01),且高于NC组(见表2)。表2 高胰岛素钳夹状态脂肪乳对大鼠血浆FFA、葡萄糖、胰岛素和脂联素水平的影响(略)

　　3 讨 论

　　大多数2型糖尿病患者并发肥胖，而过多的脂肪组织可释放FFA，使血浆FFA水平增高。许多研究已显示FFA导致IR的途径有:①增加肝脏糖异生;②损害胰岛素抑制HGP的作用;③以剂量依赖形式抑制胰岛素，刺激骨骼肌的葡萄糖利用〔4〕。

　　在基础状态，葡萄糖总出现率等于内源性葡萄糖生成率，在高胰岛素正血糖钳夹状态，内源性葡萄糖生成率等于葡萄糖总出现率减去外源葡萄糖的输注率。隔夜禁食后，肝脏是产生葡萄糖的主要器官，在本实验计算中使内源性葡萄糖生成等于HGP。在钳夹血糖稳定状态，葡萄糖清除率(glucose disappearance rate)等于葡萄糖出现率，亦等于组织对葡萄糖的利用率，因为此时肾脏的葡萄糖清除率为零。在基础状态，脂肪乳显著地增加了循环胰岛素水平，与C肽水平升高相一致，说明高FFA增加了内源胰岛素的分泌。在高胰岛素正血糖钳夹状态，各组的血浆葡萄糖水平维持相对恒定，说明高胰岛素正血糖钳夹试验很成功，由于高胰岛素可抑制FFA从脂肪组织中释放，并能增加FFA的酯化，因此钳夹状态较基础状态下血浆FFA水平下降。在高胰岛素钳夹试验中脂肪乳组与生理盐水组相比血浆胰岛素水平显著升高，但C肽水平却很低，说明内源胰岛素分泌几乎完全被外源胰岛素所抑制，血浆胰岛素水平高于相同状态盐水对照组的原因很可能是由于胰岛素清除率的下降，这一结果与既往研究报道相一致。

　　离体研究发现细胞膜中如含高多不饱和脂肪酸可增加膜流动性、胰岛素受体数量和胰岛素作用。在人的骨骼肌中，胰岛素敏感性与膜磷脂的多不饱和脂肪酸呈正相关，与饱和脂肪酸呈负相关。2型糖尿病常伴血中FFA和TG的升高,其升高甚至可发生在糖尿病发病前。糖尿病肥胖大鼠通常在9 w龄出现高血糖,而FFA升高在7 w龄即出现〔3〕。我国大庆糖尿病流行病学研究中,通过对432例非糖尿病人群长达6年的前瞻性观察发现,在调整了年龄、性别和初访时的空腹血糖及体重指数后,初访时空腹高TG血症是6年后2型糖尿病发病的独立危险因素〔5〕。血中长期FFA升高,可引起IR,其机制:(1)FFA增多使脂肪氧化增加,葡萄糖氧化受抑制;(2)抑制胰岛素介导的细胞对葡萄糖的摄取〔6〕;(3)促进糖异生;(4)引起骨骼肌、肝脏中的脂肪聚集,造成该组织的IR;(5)对胰岛素下游信号转导系统有影响。脂肪组织不仅是一个简单的能量贮存器官,同时也是一个内分泌器官,其分泌的脂联素在维持糖和脂类代谢平衡中起重要作用。

　　Maeda等〔6〕发现脂联素基因敲除后鼠表现为IR增加,给肥胖和脂肪营养不良鼠予以脂联素能增加它们的胰岛素敏感性。脂联素改善胰岛素敏感性可能通过(1)抑制肝糖的生成、输出〔7〕;(2)增加肌肉脂肪氧化、降低肌肉和肝脏的脂肪含量并降低体重〔8〕;(3)拮抗肿瘤坏死因子α的作用。罗格列酮通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ),减少参与FFA转运和氧化的基因表达,影响脂肪细胞内FFA的代谢,降低脂肪组织的脂肪分解,从而降低血FFA水平〔8〕。其增加脂联素的原理可能有(1)脂联素直接受PPARγ靶基因影响;(2)促进脂肪合成和脂肪细胞分化,分泌小的对胰岛素敏感的脂肪细胞〔9〕。

　　本研究发现,与IH组比较,Ros组GIR增加了149.6%,甚至超过正常组,Ros组的FFA水平甚至低于正常组,可能与它增加了对胰岛素敏感的小脂肪细胞有关,表明罗格列酮可能通过降低FFA、TG及增加脂联素,从不同环节缓解了IR,有明显的对抗脂毒性作用。二甲双胍通过减轻体重和降低血TG也可以部分改善IR,但未能逆转FFA增多及脂联素下降,作用强度不如罗格列酮。总之,本研究结果提示罗格列酮、二甲双胍均可显著改善大鼠的胰岛素敏感性,但两者作用机制不同,前者改善脂毒性作用更强,与PPARγ调控多种糖、脂代谢的基因作用及促进脂肪细胞的成熟等有关。

　　【参考文献】

　　1 韩 萍，张咏言，卢 雁，等.不同种类游离脂肪酸对大鼠胰岛素抵抗的影响〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2007;23：169.

　　2 Li L，Yang GY.Effect of hepatic glucose production on acute insulin resistance induced by lipidinfusion in awake rats〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10:320811.

　　3 Li TK，Carpentier A，Lewis GF,et al.Mechanisms of the free fatty acidinduced increase in hepatic glucose production〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003;284;E86373.

　　4 Griffin ME，Marcucci MI，Cline GW,et al.Free fatty acidinduced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade〔J〕.Diabetes,1999,48;12704.

　　5 Dresner A，Laurent D，Marcucci M,et al.Effects of free fatty acids on glucose transport and IRS1associated phosphatidylinositol 3kinase activity〔J〕.J Clin Invest，1999;103:2539.

　　6 Stein DT，Stevenson BE，Chester MW,et al.The insulinotropic potency of fatty acids is influenced profoundly by their chain length and degree of saturation〔J〕.J Clin Invest，1997;100:398403.

　　7 Lam KT，Werve GVD，Giacca A.Free fatty acids increase basal hepatic glucose production and induce hepatic insulin resistance at different sites〔J〕.Am J Physaol Endocrinol Metab，2003;284：E28190.

　　8 Wiesenthal SR，Sandhu H，McCall RH,et al.Free fatty acids impair hepatic insulin extraction in vivo〔J〕.Diabetes，1999;48;76674.

　　9 Stefan N，Wahl HG，Fritsche A,et al.Effect of the pattern of elevated free fatty acids on insulin sensitivity and insulin secretion in healthy humans〔J〕.Horm Metab Res，2001;33;4328.