糖尿病肾病病人醛糖还原酶基因多态性相关研究

作者：钟丽娜作者单位：青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003 【摘要】  目的 探讨醛糖还原酶(AR) 基因5′端(AC)n多态性与2 型糖尿病肾病的关系。方法 采用聚合酶链反应(PCR)、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色技术分析了139例2 型糖尿病病人(早期糖尿病肾病组61例,非糖尿病肾病组78 例) 和63 例正常对照者AR 基因5′ 端(AC)n的多态性。结果 早期糖尿病肾病组Z-2 等位基因频率高于非糖尿病肾病组和正常对照组(χ2 = 6.88、10.51，P<0.01)；含 Z-2 等位基因的基因型频率也高于非糖尿病肾病组和正常对照组(χ2=4.95、8.15，P<0. 05、0.01)。结论 AR基因Z-2 等位基因与青岛地区汉族2 型糖尿病病人糖尿病肾病的发生发展有关。 【关键词】  糖尿病肾病 醛还原酶 基因型 基因频率    STUDY ON THE GENE POLYMORPHISIMS OF ALDOSE REDUCTASE IN TYPE 2 DIABETIC NEPHROPATHYZHONG LINA, MIAO ZHIMIN, WANG ZHONGCHAO, et al(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the association between (AC)n polymorphisms at 5end of the aldose reductase gene and diabetic nephropathy of Type 2 diabetes mellitus.MethodsThe 5′ALR polymorphism in 139 patients with Type 2 diabetes (61 cases with nephropathy, 78 without nephropathy) and 63 healthy controls was identified in genomic DNA using polymerase chain reaction and PAGE gel electrophoresis together with silverstaining.ResultsThe frequency of allele Z-2 was significantly higher in patients with diabetic nephropathy compared with that of without nephrophaty and controls (χ2 = 6.88,10.51;P<0.01). The genotypic frequency of allele Z-2 was significantly higher in those with diabetic nephropathy compared with that of without nephrophaty and controls (χ2 =4.95,8.15;P<0.05,0.01).ConclusionAllele Z-2 of aldose reductase may contribute to the pathogenesis of diabetic nephropathy with type 2 diabetes mellitus.   ［KEY WORDS］diabetic nephropathies; aldose reductase; geneotype; gene frequency    糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的慢性微血管并发症之一, 大约30%～40%的糖尿病病人发生DN, DN已成为终末期肾衰竭的主要原因之一。研究显示，糖代谢的多元醇通路与DN等慢性微血管并发症密切相关。而醛糖还原酶(AR) 是多元醇通路的限速酶, 该基因表达异常或酶活性改变,将促进DM 微血管并发症的发生。近几年国内外学者研究显示，AR 基因5′端转录起始点上游2.1 kb 处存在(AC)n重复序列多态标记,该标记与DN的发生有密切关系。本研究旨在探讨青岛地区汉族2 型糖尿病病人AR 基因5′端的(AC)n多态性与糖尿病肾病的关系。    1  对象和方法    1.1  研究对象    1.1.1  2型糖尿病组  青岛大学医学院附属医院内分泌科住院及门诊青岛地区汉族2型糖尿病病人139例,病程10年以上。病人均符合1999 年WHO 糖尿病诊断和分类标准。根据24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)分为2组:早期DN组:61例, 男24例，女37例,年龄49～77岁，平均（63.89±7.82)岁,病程为(13.9±4.1)年;入选标准为6 个月内UAER 连续2 次为20 ～200 μg/min,且血清肌酐(SCr)<120 μmol/L,并排除由心、肝和其他全身疾病或原发泌尿系统疾病及应用影响肾功能药物引起微量白蛋白尿者。非糖尿病肾病（NODN）组:本组78例, 男30例，女48例,年龄为48～78岁，平均（64.13±6.58）岁,病程为(13.3±3.7)年；即糖尿病病人6个月内UAER连续2次均<20 μg/min,SCr<120 μmol/L 者。

 1.1.2  正常对照(CON)组  共63例, 男24例，女39例,年龄50～78岁，平均（64.11±7.21)岁；为青岛大学医学院附属医院健康体检成年人,经检查排除糖尿病、冠心病、高血压、高脂血症、肾脏疾病等，均无疾病家族史。

    1.2  实验方法

    1.2.1  提取外周血白细胞基因组DNA  抽取受检者外周静脉血，用Promega公司的全血DNA抽提试剂盒提取DNA，-4 ℃存放。

    1.2.2  AR等位基因检测  5′端及3′端引物序的列分别为5′GAATCTTAACATGCTCTGAACC3′, 5′GCCCAGCCCTATACCTAGT3′，均由上海生工生物工程公司合成；反应条件为：94 ℃预变性3 min,94 ℃变性45 s,60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,循环30次于72 ℃终止延伸5 min,4 ℃ 保存。取10 μL的PCR 产物与2 μL 加样缓冲液混匀后,于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶上电泳（100 mV，15 h）,保持低温。凝胶用硝酸银染色法显示结果。选取部分基因型为纯合子的PCR产物送上海生物工程公司进行测序。将其中的(AC)24等位基因命名为Z，并作为DNA标准物与其他标本一起电泳，读取各个标本的基因型。据PCR 产物由大到小各等位基因依次命名为Z+6、Z+ 4、Z+2、Z、Z-2、Z-4、Z-6。采用基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。

    1.3  统计学处理

    各组基因型频率和等位基因频率比较用χ2检验。统计分析采用SPSS 11.0软件处理。

    2  结    果

    PCR产物的长度为132～144 bp, 含(AC)n的重复数n 分别为21、22、23、24、25、26、27, 依次命名为Z-6、Z-4、Z-2、Z、Z+2、Z+4、Z+6 。各组等位基因分布频率见表1。早期DN组Z-2 等位基因频率高于NODN组和CON组, 差异均有显著意义(χ2=6.88、10.51,P<0.01)；早期DN组 Z+2 等位基因频率与NODN组和CON组比较，差异均无显著意义(χ2=2.82、2.63,P>0.05)。早期DN组含Z-2等位基因的基因型频率高于NODN组和CON组，差异均有显著意义（χ2=4.95、8.15，P<0.05、0.01）。见表2。表1  各组等位基因频率分布比较[例表2  各组含Z-2等位基因基因型频率分布比较

    3  讨    论

    临床研究表明，DN发生并不总与血糖水平和糖尿病病程有关,部分病人虽血糖控制良好也在早期即发生DN,而有些糖尿病人却终身不发生DN。因此，认为高糖血症是DN发生重要因素,但不是惟一因素。流行病学调查显示，在糖尿病病人中DN的发生均有家族集聚现象[1],不同种族DN发病率差异悬殊[2],这些都提示DN发生发展具有很高的遗传易感性。目前,多数学者认为,糖代谢的多元醇通路与糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变等慢性并发症有密切关系[3，4]。AR是多元醇通路的限速酶,该酶的活性在DN的发生、发展中起重要作用。在糖尿病高糖血症状态下,AR被激活,细胞生成大量山梨醇。由于山梨醇通过细胞膜的速度很慢,使其在细胞内积聚,引起细胞渗透性水肿和细胞结构的破坏；另外,AR激活后,还原型辅酶Ⅱ (NADPH)的消耗增加,细胞内氧化还原失衡,清除自由基的能力下降,使组织损害,最终导致病变的发生。

    1995年KO等[5]研究显示，在香港的中国人群AR 基因转录起始点的上游2.1 kb 处存在 (AC)n微卫星多态性DNA 标志, 并发现Z-2 等位基因与糖尿病视网膜病变有密切关系。同时，KUMARAMANICKAVEL等[6]和PETROVIC等[7]也分别在印第安人和高加索人中研究显示，Z-2等位基因是2型DM视网膜病变的高度危险因素，提示AR基因5′端（AC）n多态性与DM微血管并发症有关。YANG等[8]研究显示，Z-2等位基因携带者 AR基因转录活性最高，进一步证明AR多态性与DM微血管并发症有密切关系。LIU等[9]的研究显示，AR 基因5′端(AC)n多态性与2型DM病人DN的发生相关，DM病人中非微量蛋白尿组Z-2等位基因频率明显低于DN组，Z+2等位基因频率明显高于DN组，提示 Z-2等位基因则是DN  的独立危险因素，而Z+2等位基因是DN的保护因素。然而，YAMAMOTO等[1]对日本人群中的1型DM研究显示，Z+2等位基因纯合子更易于发生DN,携带有Z+2等位基因是DN发生发展的危险因素，其报道与LIU 等[9]研究结果正好相反。另有研究显示，Z-2等位基因在2型DM中出现频率高于非DM病人，但未发现该等位基因与蛋白尿呈一致相关性。本研究显示，青岛地区汉族人中也存在该微卫星多态性, DN组Z-2 等位基因频率及含Z-2 等位基因的基因型频率显著高于NODN组和CON 组,再次提示AR 基因的Z-2等位基因可能是DN 的易感因素。

综上所述, AR基因5′端(AC)n多态与DN的发生有关，Z-2等位基因可能是DN的易感基因。但微卫星基因的多态性,到底影响mRNA还是蛋白质的表达,还需进一步的研究。

【参考文献】  [1]YAMAMOTO T, SATO T, HOSOI M, et al. Aldose reductase gene polymorphism is associated with progression of diabetic nephropathy in Japanese patients with type 1 diabetes mellitus[J]. Diabetes Obes Metab, 2003,5(1):5157.

[2]WAT N M, LIU Y F. Diabetic nephropathy is associated with the 5′end dinucleotide repeat polymorphism of the aldose reductase gene in Chinese subjects with type 2 diabetes[J]. Diabetes Med, 2002,19(2):113118.

[3]李长贵,吕淑云,綦玉琴,等. eNOS基因第7外显子894G→T点突变与早期糖尿病肾病并高血压的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40（3）:200.

[4]邢广群,孙建平,刘丽秋,等. 糖尿病肾病病人血清胰岛素样生长因子的测定[J]. 青岛大学医学院学报, 2002,38(1):34.

[5]KO B C, LAM K S, WAT N M, et al. An (AC)n dinucleotide repeat polymorphic marker at the 5′ end of the aldose reductase gene is associated with earlyonset diabetic retinopathy in NIDDM patients[J]. Diabetes, 1995,44(7):727732.

[6]KUMARAMANICKAVEL G, SRIPRIYA S, RAMPRASED V L, et al. Z-2 aldose reductase allele and diabetic retinopathy in India[J]. Ophthalmic Genet, 2003,24(1): 4148.

[7]PETROVIC M G, PETERLIN B, HAWLINA M, et al. Aldose reductase (AC)n gene polymorphism and susceptibility to diabetic retinopathy in Type 2 diabetes in Caucasians[J]. Diabetes Complications, 2005,19(2):7073.

[8]YANG B, MILLWARD A, DEMAINE A. Functional differences between the susceptibility Z-2/C106 and protective Z+2/T106 promoter region polymorphisms of the aldose reductase gene may account for the association with diabetic microvascular complications[J]. Biochim Biophys Acta, 2003,1639(1):17.

[9]LIU Y F, WAT N M, CHUNG S S, et al. Diabetic nephropathy is associated with the 5′end dinucleotide repeat polymorphism of the aldose reductase gene in Chinese subjects with Type 2 diabetes[J]. Diabet Med, 2002,19(2):113118.