JNK通路介导Ghrelin对肿瘤坏死因子α诱导的HepG2细胞间黏附分子1 mRNA表达的抑制

　　作者：丁丽颖 郭闻师1 单海燕2 作者单位：(辽宁医学院附属第一医院内分泌科， 辽宁 锦州 121000)

　　【摘要】 目的 研究Ghrelin对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的HepG2细胞细胞间黏附分子1(ICAM1)mRNA表达水平的影响及cJun氨基末端激酶(JNK)在其中的作用。方法 HepG2细胞培养，加入不同浓度TNFα，采用RTPCR检测ICAM1 mRNA的水平。给予Ghrelin预处理1 h后,再加入TNFα检测ICAM1变化。免疫印迹法检测胞浆pJNK的表达。结果 TNFα浓度依赖地增高HepG2细胞ICAM1 mRNA的表达;Ghrelin 组的ICAM1 mRNA的表达减低; TNFα组pJNK增加，Ghrelin组较TNFα组减少。结论 TNFα可能通过pJNK通路介导HepG2细胞 ICAM1 mRNA的表达;Ghrelin可能通过抑制pJNK通路抑制 ICAM1的表达。

　　【关键词】 肿瘤坏死因子α;细胞间黏附分子1;HepG2;Ghrelin;cJun氨基末端激酶

　　除对糖脂代谢有影响外，Ghrelin在许多组织如心血管和免疫组织等表达〔1〕，具有心血管保护的功能。近来Ghrelin与炎症的关系日益受到重视。细胞间黏附分子1(ICAM1)是膜糖蛋白，ICAM的高表达和它们的配体介导白细胞在血管表面的黏附，聚集和迁移是动脉粥样硬化的基本过程。已有研究证明ICAM1恢复到基线水平可作为动脉硬化性心血管疾病表面治愈的预测因素〔2〕。肿瘤坏死因子α(TNFα)已被公认在肥胖的个体中产生胰岛素抵抗。以往研究表明胰岛素抵抗状态下存在的炎症因子TNFα可以刺激ICAM1的产生。肝脏是血浆ICAM1主要的产生之一，但在肝脏细胞上此类研究尚少。基于Ghrelin对炎症有调节作用，我们通过研究Ghrelin对TNFα诱导的肝HepG2细胞ICAM1 mRNA表达的影响而探讨Ghrelin在肝脏部位的抗炎功能，为可能的Ghrelin应用于临床糖尿病心血管并发症的防治提供研究的线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞、试剂与仪器 HepG2细胞株由中国医科大学肿瘤研究所贾兰玲老师惠赠，为ATCC来源细胞细胞株代号为GDC024。试剂：rhTNFα购于Sigma;人Ghrelin购于Phoenix Pharmaceuticals Inc; TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0购于大连宝生物工程有限公司;pJNK 小鼠抗人单克隆抗体购于碧云天公司;βactin小鼠抗人单克隆抗体购于Santa Cruz;其他药品为市售分析纯。PCR扩增仪(Biometra)，自动凝胶成像分析系统(Flourchen V2.0 stand Alone)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 HepG2细胞的培养与分组 将HepG2细胞用含10%新生牛血清和100 U/ml青霉素和链霉素100 μg/ml的DMEM培养液在37℃，5%CO2 的条件下在培养箱中饱和湿度培养，每2天换液1次，待细胞处于亚融合状态时，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化传代，待细胞涨至亚融合状态时用于实验。胰酶消化后，制成单细胞悬液,以5×105/孔接种到6 孔板中，生长至90%融合。用不含血清的DMEM 培养基培养24 h后，PBS清洗2～3次,加入条件培养基。TNFα(浓度分别为0.1、1、10 ng/ml),作用时间24 h;TNFα(1 ng/ml)作用2、6、24 h,同时设正常对照组。Ghrelin预处理组先加入Ghrelin 10 ng/ml预处理1 h 后，加入TNFα，终浓度为1.0 ng/ml,培养24 h，弃培养液加入Trizol试剂，裂解细胞，提取RNA。

　　1.2.2 细胞总RNA的提取及ICAM1 mRNA的表达 使用Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量样品的吸光度。引物根据Gen Bank中ICAM1 cDNA序列设计：上游引物：5′CAGTGACCATCTACAGCTTTCCGG3′，下游引物：5′GCTGCTACCACAGTGATGATGACAA3′，扩增片段为556 bp;βactin 上游引物：5′AAATCGTGCGTGACATTAA3′，下游引物5′CTCGTCATACTCCTGCTTG3′，扩增片段为473 bp。RTPCR的具体操作按试剂盒说明进行。

　　1.2.3 免疫印迹法检测pJNK、βactin的表达 用100 ng/ml Ghrelin预处理细胞1 h后加入10 ng/ml的TNFα,分别培养30 min，收集细胞,提取蛋白，检测pJNK、βactin表达。

　　1.3 统计学分析 计量资料以x±s表示。采用SPSS13.0软件包进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法。

　　2 结 果

　　2.1 TNFα对HepG2细胞ICAM1 mRNA 表达的影响 本实验所提取的细胞总RNA样品用紫外分光光度计测定的A260/A280在1.8～2.0 之间,表明总RNA纯度良好,无蛋白质等污染。未经刺激的HepG2细胞ICAM1 mRNA表达水平很低(1.000 0),TNFα刺激后，HepG2 细胞ICAM1 mRNA表达增强(P<0.05),其表达量随TNFα浓度增高而增高(0.1 ng/ml，1.527 1±0.111 7;1.0 ng/ml，2.097 7±0.074 8;10 ng/ml，2.555 4±0.096 6);βactin各组表达基本一致，见图1。以浓度1.0 ng/ml的TNFα分别作用于HepG2细胞2、6、24 h，细胞内ICAM1 mRNA表达分别为2.099 1±0.133 6，3.715 8±0.143 4和2.222 4±0.112 5，与相同时相对照组比较(分别为1.00 0，1.326 7±0.093 9和1.288 5±0.035 7)均有明显增高(P<0.05)，在6 h时TNFα作用最为明显，ICAM1 mRNA表达达高峰，24 h作用仍很显著，见图2。

　　M：marker;1：对照组;2：TNFα 0.1 ng/ml;3：TNFα 1.0 ng/ml;4：TNFα 10 ng/ml

　　图1 TNFα对HepG2细胞ICAM1 mRNA表达的影响M： marker;1：2 h 对照组;2：2 h TNFα 1.0 ng/ml;3：6 h对照组;4：6 h TNFα 1.0 ng/ml;5：24 h对照组;6：24 h TNFα1.0 ng/ml

　　图2 TNFα作用不同时间HepG2细胞

　　ICAM1 mRNA的表达

　　M：marker; 1：对照组; 2：TNFα 1.0 ng/ml; 3：Ghrelin 10 ng/ml;4：TNFα 1.0 ng/ml+Ghrelin 10 ng/ml

　　图3 Ghrelin对TNFα诱导的HepG2细胞

　　ICAM1 mRNA表达的影响2.2 Ghrelin预处理对TNFα诱导的HepG2细胞ICAM1 mRNA表达的影响 未经刺激的的HepG2细胞ICAM1 mRNA水平很低(1.000 0)。Ghrelin单独作用对ICAM1表达影响不显著(1.099 8±0.118 5)。TNFα刺激后，HepG2 细胞ICAM1 mRNA表达增强(2.222 4±0.112 5)(P<0.05),而Ghrelin预处理可以减少TNFα诱导的ICAM1的表达(1.404 1±0.507 2)(P<0.05);βactin各组表达基本一致，见图3。

　　2.3 Ghrelin对TNFα诱导的胞浆pJNK蛋白表达的影响 正常情况下，HepG2胞浆表达一定的pJNK蛋白(1.000 0)，10 ng/ml TNFα刺激30 min后，胞浆中的pJNK蛋白明显增加(1.681 5±0.030 2)(P<0.05)， Ghrelin单独作用组pJNK蛋白表达(1.044 5±0.070 0)较正常对照组无明显差异;而Ghrelin预处理组胞浆中的pJNK蛋白较TNFα组明显减少(1.506 6±0.022 6)(P<0.05)。各组βactin蛋白表达无明显差异，见图4。

　　A:对照组; B:TNFα 10 ng/ml; C:Ghrelin 100 ng/ml; D:TNFα 10 ng/ml+ Ghrelin 100 ng/ml

　　图4 Ghrelin预处理对TNFα诱导的HepG2细胞

　　胞浆pJNK表达的影响

　　3 讨 论

　　Ghrelin 是从小鼠和人的胃内分泌细胞中分离出来的一种新的脑肠肽,目前其功能还未完全明确。对Ghrelin作用的研究，主要集中在促生长激素(GH) 分泌方面,与生长和能量平衡的调控相关联，并可促胃酸分泌,提高食欲,增加脂肪。同时,其受体分布的广泛性又决定Ghrelin 可能具有更广泛的生物学效应。ICAM1是膜糖蛋白，ICAM的高表达和它们的配体介导白细胞在血管表面的黏附，聚集和迁移是动脉粥样硬化的基本过程，已有研究证明ICAM恢复到基线水平可作为动脉硬化性心血管疾病表面治愈的预测因素，它们之间的关联性已被很好证明〔4〕。与无代谢综合征的个体相比，游离ICAM1在代谢综合征个体浓度增高。TNFα已被公认在肥胖的个体中产生胰岛素抵抗，其在胰岛素抵抗状态下，可以刺激ICAM1的产生。肝脏是血浆ICAM1主要的产生部位之一，但在肝脏细胞上此类研究尚少。研究证实血浆Ghrelin的水平在饥饿时提高，在摄食后下降，在肥胖和糖尿病患者血浆中水平明显低下，血浆中Ghrelin与糖尿病和肥胖负相关〔5〕。有证据显示，在代谢综合征表达ICAM1上，TNFα通路有特殊的作用。我们的研究结果显示， TNFα明显提高肝细胞株HepG2细胞ICAM1 mRNA表达，其可能是肥胖的糖尿病患者和胰岛素抵抗个体易患动脉硬化的原因之一;Ghrelin可抑制TNFα诱导的ICAM1mRNA的增高，证实Ghrelin在肝脏具有抑制炎症因子表达的作用，这是Ghrelin独立于调节糖脂代谢之外的作用。

　　大量研究显示MAPK通路与TNFα诱导的ICAM1分泌密切相关。MAPK途径是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路之一。JNK也称应激蛋白激酶，是MAPK家族之一，参与应激反应和细胞死亡。越来越多的证据证明JNK生物学效应较为复杂。已经证明JNK可介导组织产生过氧化物，表达黏附分子及趋化因子，从而产生组织损伤。我们的结果初步推断Ghrelin可能通过干预JNK通路的激活来减少TNFα诱导的ICAM1的分泌。这可能是Ghrelin抑制ICAM1分泌的机制之一。

　　我们的研究结果显示，减少的内源性的Ghrelin能潜在引起促炎症状态和在肥胖的患者中提高动脉硬化的发病率〔6〕。Ghrelin的干预治疗对预防和减少胰岛素抵抗患者的炎症状态可能存在潜在的作用，但能否明显减少糖尿病和胰岛素抵抗患者动脉硬化疾病和心脏事件还有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Nagaya N，Kojima M，Uematsu M,et al.Hemodynamic and hormonal effects of human Ghrelin in healthy volunteers〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2001; 280(5):R14837.

　　2 BlancoColio LM，MartínVentura JL，de Teresa E，et al.Elevated ICAM1 and MCP1 plasma levels in subjects at high cardiovascular risk are diminished by atorvastatin treatment.Atorvastatin on inflammatory markers study:a substudy of achieve cholesterol targets fast with atorvastatin stratified titration〔J〕.Am Heart J，2007;153(5):8818.

　　3 Gauna C，Delhanty JD，Hofland LJ，et al.Ghrelin stimulates，whereas desoctanoyl Ghrelin inhibits，glucose output by primary hepatocytes〔J〕.J Clin Endocr Metab，2005;90(2)：105560.

　　4 Cao LH，Lee YJ，Kang DG，et al.Effect of Zanthoxylum S chinifolium on TNFalphainduced vascular inflammation in humman umbilical vein endothelial cells〔J〕.Vascul Pharmacol，2009;50(56)：2007.

　　5 Ikezaki A，Hosoda H Ito K,et al.Fasting plasma Ghrelin levels are negatively correlated with insulin resistance and PAI1，but not with leptin，in obese children and adolescents〔J〕.Diabetes，2002;51(12):340811.

　　6 Li WG，Gavrila D，Liu X，et al.Ghrelin inhibits proinflammatory responses and nuclear factorB activation in human endothelial cells〔J〕. Circulation，2004;109(18):22216.