IL18基因启动子区607C/A位点多态性与痛风发病相关性

　　作者：王新凤1，袁鹰2，李长贵3，刘世国4 作者单位：(青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266003)

　　【摘要】 目的 探讨山东汉族人白细胞介素18(IL18)基因启动子区607C/A位点单核苷酸多态性与痛风易感性之间的关系。方法 应用聚合酶链反应序列特异性引物技术，检测100例痛风病人和100例非痛风病人IL18基因启动子区607C/A单核苷酸多态性位点的基因型。结果 非痛风病人和痛风病人IL18基因启动子区607C/A位点3种基因型频率分别为：AA型0.18(18/100)、0.18(18/100)，AC型0.58(58/100)、0.67(67/100)，CC型0.24(24/100)、0.15(15/100)。IL18基因启动子区607C/A位点的基因型和等位基因频率在两组之间分布无明显差异。结论 山东汉族人群中IL18基因启动子区607C/A位点存在多态性，但痛风与该多态性无相关性。

　　【关键词】 痛风;白细胞介素18;多态性,单核苷酸

　　THE RELATIONSHIP BETWEEN THE MONONUCLEOTIDE POLYMORPHISM (SNP) AT POSITION607 AT THE PROMOTER REGION OF INTERLEUKIN18 GENE AND GOUT MORBIDITY WANG XINFENG, YUAN YING, LI CHANGGUI, et al(Department of Endocrinology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To investigate the mononucleotide polymorphism (SNP) at position607 at the promoter region of interleukin18 (IL18) gene for the association with gout in Chinese Han population of Shandong province. Methods The polymorphism of promoter region in the IL18 gene (607C/A) was studied in 100 gout patients and 100 nongout controls by using sequencespecific primers polymerase chain reaction (PCRSSP) and sequencing. Results The frequency of AA genotype in IL18607C/A was 0.18 (18/100) in normal controls and 0.18 (18/100) in patients. The frequency of AC genotype was 0.58 (58/100) in normal controls and 0.67 (67/100) in the patients. The frequency of CC genotype was 0.24 (24/100) in nongout group and0.15 (15/100) in gout group. There was no significant difference in terms of the frequencies of alleles and genotype of IL18607C/A between the two groups. Conclusion IL18607C/A polymorphism exists in Chinese Han population of Shandong province. However, there is no relationship for polymorphism of IL18607C/A between gout group and nongout group.

　　[KEY WORDS] gout; interleukin18; polymorphism, single nucleotide

　　痛风是由于嘌呤代谢紊乱导致血尿酸增高而引起组织损伤的一组疾病,是由遗传性和获得性引起的尿酸排泄减少和嘌呤代谢障碍。随着经济的发展和生活水平的提高,原发性痛风患病率明显增高。原发性痛风发病机制复杂，涉及分子生物学、遗传学等诸多领域。 研究证实痛风发作时滑膜细胞分泌一系列的炎症因子，导致炎症细胞的浸润，引起组织结构的破坏及功能的障碍。已有研究显示，白细胞介素18(IL18)作为一种前炎症因子，在痛风性关节炎急性发作时血清中的水平较对照组明显升高[1]。IL18是IL1超家族成员，其功能复杂。IL18最初被命名为“IFNγ诱生因子”，具有与IL12相似的生物学活性，增强T和NK细胞成熟、产生细胞因子及发挥细胞毒性作用。 它位于11号染色体长臂，由6个外显子和5个内含子组成，其中位于第一外显子上游315～1 357 bp的区域对IL18的表达具有重要的调控作用。本研究应用聚合酶链反应序列特异性引物(PCRSSP)技术检测IL18基因单核苷酸多态性(SNP)，从而探讨IL18 基因启动子区607位点SNP与痛风易感性之间的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　痛风病人来源于2008年7月—2009年1月青岛大学医学院附属医院门诊和住院痛风病人及山东沿海地区流行病学调查收集的原发性痛风病人共100例，全部为男性病人，平均年龄54.6岁。均符合1997年美国风湿病协会制定的诊断标准，并排除有肾衰竭、肿瘤和其他自身免疫性疾病者。对照组为随机选取的青岛及山东沿海地区无血缘关系的非痛风男性病人100例，平均年龄49.0岁。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 基因组DNA的提取 两组病人均于清晨空腹采集静脉血4 mL，EDTA抗凝。按标准的酚氯仿法抽提DNA，所有DNA样本置-20 ℃保存。

　　1.2.2 PCR引物设计与合成 根据IL18 基因启动子607C/A位点多态性和已知的DNA序列，参照文献[2]设计 PCR引物(表 1)，由上海生工生物技术有限公司合成。其中特异性引物的3′端碱基根据多态性序列与其严格互补，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增条带;而内参照引物扩增包含有特异性突变位点的DNA片段，用于判定整个PCR体系的成功与否。表1 IL18基因启动子607位点序列特异引物引物序列长度(bp)上游引物5′

　　1.2.3 PCR反应体系及反应参数 PCR扩增体系总体积为25 μL，包括：Taq 酶2 U,10×PCR缓冲液(Mg2+plus)2.5 μL，dNTP 2.5 mmol/L，基因组DNA 100 ng,IL18基因上下游引物各1 μmol/L,阳性内对照引物1 μmol/L，不足部分用双蒸水补足。PCR扩反应增条件：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，15个循环;然后94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共15个循环;最后72 ℃延伸7 min。每次PCR反应均设阳性、阴性和空白对照(100 bp DNA Ladder Marker作为分子质量标准)。每份样本的PCR扩增产物在溴化乙锭染色的15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，紫外线灯下观察结果，自动凝胶成像分析系统进行成像和分析。

　　1.2.4 序列分析 为验证PCRSSP反应结果的准确性，在两组的各基因型中随机选取样本共12份，用内参照引物进行PCR扩增后送北京三博远志公司进行序列测定。

　　1.3 统计学处理

　　两组IL18基因位点的群体代表性采用HardyWeinberg遗传平衡定律检验。基因型和等位基因频率在两组中的分布差异采用χ2检验,在SPSS 13.0软件包上进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 IL18基因启动子607C/A位点多态性检测

　　IL18基因启动子607C/A多态性位点PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条长301 bp阳性对照带和一条长196 bp条带。其位点的多态性分为3种基因型：AA型、CC型和AC型(图1)。随机抽取的3种基因型扩增产物的测序结果与琼脂糖凝胶基因分型的结果相符(图2)。

　　2.2 两组IL18基因启动子607C/A位点多态性的比较

　　对照组的IL18基因启动子607C/A基因型频率和等位基因频率分布符合HardyWeinberg平衡(P>0.05)，具有群体代表性。在对照组中，基因型频率分布以AC型最为多见，CC型最为少见，AA型居中。等位基因频率以C等位基因最为多见。IL18基因启动子607C/A位点的基因型和等位基因频率分布在两组之间无明显差别。见表2。

　　3 讨 论

　　原发性痛风是一种嘌呤代谢紊乱性疾病，是由表2 两组IL18基因启动子607C/A位点基因型和等位基因频率的分布(例)组别n等位基因AC基因型AAACCC痛风组10010397186715对照组10094106185824

　　遗传背景与环境因素共同作用导致的疾病[3]。临床特点为高尿酸血症及由此引起的急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，痛风结晶沉积在肾脏可引起间质性肾病和肾结石。本病发病机制复杂，涉及尿酸生成、排泄等领域，目前除了确定少数由于酶缺陷引起外，大多机制未阐明。由于本病是一种炎症性疾病，因此所有参与痛风炎症反应过程的基因位点可能都是痛风的易感基因。有研究显示，痛风性关节炎发作时血清中IL18的水平较对照组增高。

　　IL18是一种前炎症因子，功能众多。能够诱导IFNγ的产生，被命名为IFNγ诱生因子;能增加NK细胞和Th1细胞的细胞毒作用，从而促进Th1型免疫反应，并且它自身还能介导T细胞和NK细胞分泌IL4、IL5、IL10和IL13等炎症因子，并能促进中性粒细胞的聚集[46]。

　　编码IL18的基因位于人类第11号染色体11q22.2q22.3 上，在众多的多态性位点中研究最多的是启动子607、137两个SNP位点。研究显示，607C/A和137G/C能影响IL18基因启动子活性[2]。607位点由C变为A阻断cAMP 应答元件结合蛋白(CREB) 结合位点,从而抑制受CRE 调控的基因转录。137位点由G变为C 改变核因子H4 TF21 的结合位点,阻断受H4 TF21 调控的基因转录。因此,等位基因607C和137G表达蛋白水平较高。许多疾病的发生都与IL18有关，如病毒感染性疾病、自身免疫性疾病。ZHANG 等[7]分析IL18基因启动子区607 和137位点SNP 与汉族人慢性乙型肝炎的关系，结果显示慢性乙型肝炎病人607C/137C 和607A/137C 单倍体分布频率明显低于对照组。HIROMATSU等[8]的研究结果显示，IL18基因启动子区4675位GG基因型或4675 G/607A/137G单体型可能是患GRAVES病的保护性基因。最近，类风湿性关节炎与IL18基因SNP的关系备受关注。有研究显示，IL18607AA基因对类风湿性关节炎的发展有保护性作用。但PAWLIK等[9]对波兰人的研究显示，IL18与该疾病的严重程度没有相关性。另有研究结果显示，在肾上腺皮质和非肥胖糖尿病小鼠的胰腺IL18 mRNA也有表达[1011]。因此，IL18除了具有免疫系统的功能外，可能与其他的生理系统如内分泌和神经系统有关。痛风性关节炎不仅是一种代谢性疾病也是一种炎症性疾病，因此，研究IL18基因SNP与痛风性关节炎易感性的关系有重要意义。

　　本研究结果显示，IL18基因607C/A位点等位基因频率与对照组相比差别无统计学意义;3种基因型频率分布也无统计学意义。但是，是否IL18基因启动子区多态性与痛风发病有关联还不能下定论。首先，所有编码IL18基因存在多种SNP位点，由于受多种原因的影响目前研究最多的是启动子区607、137两个位点，其他位点的SNP与IL18表达量及痛风发病易感性的关系还没有确定。其次,不同国家、不同种族、不同地区在遗传背景方面存在着差异。本研究初步证明，中国汉族人存在的IL18基因外显子1上游607C/A位点多态性与痛风的易感性之间可能没有关系，但由于受样本量的限制，仍然有必要扩大样本量进一步研究。再次，原发性痛风是一种多基因遗传疾病，遗传背景复杂，在遗传模式上表现为以微效基因为主的主效、中效和微效基因多种形式并存。即使单个SNP位点改变与痛风发病有相关性，也需要将多个SNP位点结合起来组成一个单倍型进行分析研究。

　　综上所述，山东汉族人群IL18基因启动子607C/A位点SNP可能和痛风的发病无关，但鉴于IL18基因启动子区仍有多个SNP位点本实验未涉及，同时IL18有众多的生物学作用，找到影响IL18活性的基因位点将为以后基因治疗提供靶目标。因此，有必要对此作进一步研究。

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