糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义

　　作者：柳迎昭， 吴晨光, 宋丽敏， 沈莉敏， 姚翡 作者单位：江苏大学附属人民医院内分泌科，江苏 镇江212002

　　【摘要】 目的： 建立糖尿病大鼠模型，探讨糖尿病大鼠尿中nephrin 的检测、动态变化及意义。方法： SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液，动态检测各组大鼠24 h尿微量白蛋白及肾功能，以Western-Blot 方法动态检测尿中nephrin。结果： 正常大鼠尿中无nephrin排泄，而糖尿病大鼠尿中可检测出nephrin，诱模早期(2周)即可出现，随着病程的延长，nephrin逐渐增多，8周达高峰后，nephrin的排泄又逐渐减少。结论： 糖尿病肾病早期nephrin即可从尿中排泄，尿nephrin可作为糖尿病肾病的早期诊断指标之一，还将有助于监测、判断糖尿病肾病的病程进展。

　　【关键词】 糖尿病肾病;大鼠;微量白蛋白; 尿nephrin

　　[基金项目] 镇江市社会发展基金资助项目(SH2006041)

　　Measurements of nephrin in diabetic rats urine　and its clinical significance

　　LIU Ying-zhao, WU Chen-guang, SONG Li-min, SHEN Li-min, YAO Fei

　　(Department of Endocrinology, Affiliated People Hospital, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001,China)

　　[Abstract] Objective: Diabetic rats were induced to explore the detection of urinary nephrin in diabetic rats, its dynamic changes and clinical significance.Methods： SD rats were divided into 2 groups. Diabetic rats model were induced by single intraperitoneal injection of streptozocin(STZ),while those of normal control group were injected with equal dosage of citric acid buffer solution. Twenty four hours urinary microalbumin and renal function were ambulatorily monitored, and Urinary Nephrin was measured with Western-Blot. Results： The test showed that no urinary nephrin were found in normal control group, but it was decteted out in diabetic rats group, and discovered at the early stage(2 weeks after STZ injection).With the extension of course, urinary nephrin gradually increased, and then gradually decreased after reaching its peak by week 8. Conclusion： The nephrin could be excreted out from urine at the early stage of diabetic nephropathy. Urinary nephrin could not only be regarded as a specific index for the early diagnosis of diabetic nephropathy, but also be benificial to clinical monitoring and evaluating the degrees of the DN.

　　[Key words] diabetic nephropathy; rats; microalbumin; urinary nephrin

　　糖尿病肾病(diabetes nephropathy，DN)是糖尿病微血管病变之一，是终末期肾衰的重要原因，早期诊断和治疗可延缓其发展。DN起病隐匿，早期诊断困难，目前公认的诊断早期DN的指标是尿微量白蛋白，但也仅使DN诊断提早到依据Mogensen建议的Ⅲ 期。部分糖尿病患者当发现微量白蛋白尿时，肾脏的结构损害已很明显[1]。因此不能单以尿微量白蛋白的出现来判断早期DN。

　　蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关，nephrin是新近发现由足细胞表达、特异定位于肾小球足细胞裂孔隔膜的蛋白分子，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能[2]。研究表明，实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有nephrin表达的改变，且nephrin可从尿中排泄[3]。而尿中nephrin排泄量增加是否可敏感反映糖尿病早期肾脏损害，目前国内尚未有报道。本文对糖尿病大鼠尿蛋白排泄率(AER)及尿液nephrin进行动态观察，旨在探讨尿nephrin在DN中的变化规律及其对早期DN的诊断意义。

　　1 对象与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　雄性SD大鼠76只，体质量230～280 g，购自江苏大学医学院实验动物中心，血糖正常。试验期间，室温控制在18～20℃，湿度48%，12小时交替照明，大鼠自由饮水进食，保持垫料干燥。实验共分对照组(n=36)，糖尿病组(n=40)。对照组0周处死6只，再与糖尿病组随机分为2，4，6，8和12周5个亚组，分别于DM诱模后2，4，6，8和12周处死。

　　1.2 糖尿病模型的建立

　　所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只，禁食12 h后，空腹状态下，链脲佐菌素(STZ)按55 mg/kg一次性腹腔注射制备糖尿病模型，STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1 mmol/L, pH4.2)配制。24 h后大鼠血糖开始升高，72 h后剪尾采血测血糖，持续高于16.7 mmol/L为DM模型建立成功[4,5]。DM模型建成后，每周测血糖一次，不符合标准者弃去。共有36只造模成功，其中有3只死亡。正常对照组仅注射等量枸橼酸钠缓冲液(0.1 mmol/L)。全部大鼠自由饮食。

　　1.3 标本留取

　　实验初，处死6只大鼠作为正常对照，并分别于注射STZ后2，4，6，8，12周末，对照组、糖尿病组随机取大鼠各6只，分别放入代谢笼中收集24 h尿液，计尿液总量后离心(2 000 r/min,10 min)，取上清液10 ml，-20 ℃冰箱保存待测。予0.3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉下，剪尾采血测血糖，腹部正中切口，心脏采血5 ml，分离血清，用于生化指标测定。

　　1.4 指标观察和测定方法

　　1.4.1 生化指标检测 采用免疫比浊法测定24 h 尿微量白蛋白;采用全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)、血肌酐、尿肌酐，按公式Ccr=[尿肌酐浓度(μmol/L)×每分钟尿量(ml/min)]/[血浆肌酐浓度(μmol/L)·体质量(kg)]计算血清肌酐清除率。

　　1.4.2 蛋白质印迹杂交 取大鼠24 h尿液离心后的上清液。每1 ml尿液样品置透析袋中用聚乙二醇8000高渗浓缩至100 μl标本。组内大鼠各取等体积离心浓缩尿液混合，将各组大鼠等体积尿混合液经12%SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维膜上，用封闭蛋白干粉封闭后，分别加入一抗(兔抗鼠nephrin，1∶200稀释，购自Sigma公司)过夜，然后加相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)进行孵育，显色后，用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的光密度值(D)。

　　1.5 统计学处理

　　计量资料以x±s表示, 采用SPSS10.0统计软件进行分析, 组间资料两两比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 血糖和一般情况

　　在实验期间，糖尿病组大鼠均表现出多饮、多尿、多食及体质量减轻的症状，各周血糖均明显高于对照组(P<0.05),提示糖尿病造模成功。

　　2.2 不同时间点肾功能和尿蛋白定量的变化

　　由表1看出，注射STZ后，糖尿病模型组2周尿中微量白蛋白开始升高，但与对照组相比，差异无统计学意义。4周时，尿微量白蛋白显著高于对照组(P<0.05)，表明糖尿病肾病已形成，之后尿中持续有白蛋白，并逐渐增多。模型组大鼠血清BUN逐渐升高，4周后明显高于对照组，内生肌酐清除率逐渐下降，4周后明显低于对照组，有显著性差异(P<0.05)，而早期(2周时)差异均无统计学意义。各组大鼠血糖及肾功能、尿蛋白的比较见表1。

　　表1 各组血糖、肾功能、尿蛋白的比较(略)

　　Tab 1 Comparison of the Glu, BUN,Ccr and microalbumin between two groups

　　▲:与对照组相比，P<0.05

　　2.3 各组大鼠尿nephrin的测定结果

　　正常对照组尿中无nephrin，糖尿病大鼠尿中可出现nephrin，最早出现在2周(2.17)，此时，尿中微量白蛋白增加尚不明显，随着病程的延长，尿中白蛋白明显增多，尿中nephrin也逐渐增多，8周达高峰(3.71)，以后又渐减少。见图1。

　　1:对照组;2:糖尿病2周;3:糖尿病4周;4:糖尿病6周;5:糖尿病8周;6: 糖尿病12周

　　图1 各时间点尿nephrin 蛋白质印迹结果(略)

　　Fig 1 Western blotting of nephrin in diabetic rats urine

　　3 讨论

　　糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症之一，早期诊断并进行积极有效的治疗可延缓糖尿病肾病的发生和发展。微量白蛋白尿是目前公认的诊断早期糖尿病肾脏损害的主要指标，然而在发现微量白蛋白尿的糖尿病患者中大约2/3的患者会发展为进行性的肾脏损害。

　　蛋白尿是糖尿病肾病的主要临床表现，其发生主要取决于肾小球的滤过功能。肾小球滤过屏障结构,特别是其外层的裂孔隔膜及蛋白尿发生的分子机制一直是肾病研究者的研究热点。近年来，国外通过研究先天性及遗传性肾病发现了一些与蛋白尿发生发展相关的基因及其编码的蛋白，nephrin 是第一个被确定的肾脏滤过屏障结构蛋白分子。Tryggvason 等[6]于1998年发现先天性肾病综合征(芬兰型) 的致病基因NPHS1，NPHS1基因的突变导致其基因产物nephrin蛋白不能表达在裂孔膜,从而影响肾小球滤过屏障,引起大量蛋白尿，随后的研究[7]发现在原发型肾病综合征，PAN模型肾组织中nephrin表达异常，提示肾病性蛋白尿与nephrin表达异常有关。进一步的试验表明，在糖尿病大鼠模型中，糖尿病肾病时肾组织nephrin表达发生改变。因此，nephrin在糖尿病肾病蛋白尿的形成中也起了重要作用，检测尿中nephrin 的水平可能对糖尿病肾脏损害的早期诊断具有重要意义。

　　我们的研究发现，正常大鼠尿中无nephrin，模型组大鼠尿中可检测到nephrin，且在糖尿病肾病早期(注射STZ后2周)尿中即出现。此时，尿中微量白蛋白增加尚不明显，提示尿中nephrin早于微量白 蛋白尿出现之前，可以作为糖尿病肾病的早期监测指标。尿nephrin随着微量白蛋白尿程度的加重而进行性增加，至8周达高峰后，出现下降，而蛋白尿继续加重，提示尿nephrin排泄与糖尿病肾病的病变程度密切相关。文献报道，糖尿病大鼠早期nephrin mRNA表达增高，而肾组织nephrin蛋白表达却是降低的，mRNA和蛋白呈现相反的变化，这一现象至今尚未能得到合理解释。结合本实验结果，我们认为，nephrin从尿中排泄，导致糖尿病大鼠肾小球nephrin 表达减少，使肾小球滤过屏障破坏，导致尿蛋白增多,与文献[3,8]报道相符。

　　【参考文献】

　　[1] 肖厚勤,张建鄂.糖尿病肾病患者尿中结缔组织生长因子的检测及意义[J].临床内科杂志，2004,21(8):527-529.

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　　[3] Aaltonen P,Luimula P,Astrom E,et al.Changes in the expression of nephrin gene and protein in experimental diabetic nephropathy[J].Lab Invest,2001,81(9):1185-1190.

　　[4] 雷作熹,罗 仁,董晓蕾,等.STZ诱导糖尿病肾病大鼠模型的建立[J].中国实验动物学报,2005,13(3):163-165.

　　[5] 蒋秀琴,缪 珩,耿厚法,等.匹格列酮对糖尿病大鼠TNF-α表达的影响[J].江苏大学学报:医学版，2006, 16(6):504-506.

　　[6] Tryggvason K. Unraveling the machanisms glomerular ultrafiltration:nephrin,a key compinent of the slit diaphragm[J].J Am Soc Nephrol,1999,10(11):2440-2445.

　　[7] Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, et al. Expression of podocyte-associated molecules in acquired human kidney diseases[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14:2063-2071.

　　[8] Benigni A,Gagliardini E,Tomasone S,et al. Selective impairment of gene expression and assembly of nephrin in human diabetic nephropathy[J]. Kidney Int,2004,65(6):2193-2200.