饱和脂肪酸对胰岛β细胞凋亡和细胞周期进程的影响

　　作者：崔巍，黄葶，刘均利，施秉银 作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院内分泌科，陕西西安 710061;2. 麦吉尔大学内科学系，加拿大蒙特利尔 H3A1A1

　　【摘要】 目的 探讨饱和脂肪酸棕榈酸(palmitate acids, PA)对MIN6胰岛β细胞生长、增殖及凋亡的影响，研究诱导MIN6细胞凋亡，抑制细胞周期进程的可能细胞分子机制。方法 采用MTT法检测细胞活力，流式细胞仪测定细胞周期，AnnexinⅤ/FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡。应用Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK4的表达水平，以及抗凋亡蛋白家族(IAP)XIAP和cIAP2的表达水平。结果 和对照组相比：①不同浓度PA显著抑制MIN6细胞增殖(P<0.01);②不同浓度PA作用均呈时间与剂量依赖性诱导MIN6细胞凋亡(P<0.01);③PA亦能显著抑制细胞周期进程，使MIN6细胞周期更多滞留在G0/G1期(P<0.01)，G2/M期与S期细胞比例降低(P<0.01);④用Western blot检测发现：和对照组相比，PA降低磷酸化AKT、XIAP和cIAP2的表达水平(P<0.01)，以及降低细胞周期蛋白CDK4、cyclin D1(P<0.01)的表达水平。结论 PA能抑制胰岛β细胞的生长、增殖和诱导凋亡，可能是通过降低cyclin D1和CDK4活性，使细胞滞留在G0/G1期，抑制细胞周期进程，影响其复制;同时降低抗凋亡蛋白XIAP和cIAP2的活性，促使细胞的凋亡。

　　【关键词】 胰岛细胞 饱和脂肪酸 增殖 凋亡

　　Saturated fatty acids trigger apoptosis and inhibit cell cycle　progression in insulinoma cells

　　CUI Wei, HUANG Ting, LIU Junli, SHI Bingyin

　　1. Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710061, China; 2. Department of Medicine,McGill University Health Center, Montreal, Quebec, H3A1A1, Canada

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of saturated fatty acid palmitate acids (PA) action on viability, proliferation and apoptosis of murine insulinoma MIN6 cells, and the possible intracellular pathways activated by PA. Methods Cell viability was evaluated with MTT reduction conversion assay. The AnnexinⅤ/FITC cell death detection kit was used to monitor PAinduced apoptosis. (IAP) family (XIAP and cIAP2), cyclin D1 and CDK4 were further detected using Western blot. Results ① PA of different concentration significantly inhibited the proliferation of MIN6 cells (P<0.01). ② PA increased MIN6 cell apoptosis in time and concentrationdependent manners (P<0.01). ③ The G0/G1 cell cycle arrest was also induced by PA (P<0.01), whereas MIN6 cells in S and G2/M phase were decreased (P<0.01). ④ Western blot revealed that PA reduced the level of AKT phosphorylation (P<0.01), decreased the expression of XIAP (P<0.01) and cIAP2 (P<0.01) compared to BSAtreated control cells. PA also reduced protein expression of cell cyclerelated molecules, CDK4 (P<0.01), and cyclin D1 (P<0.01) compared to BSAtreated control cells. Conclusion Our results thus suggest that PA directly affects pancreatic βcell cell proliferation, possibly by inhibiting Akt kinase and reducing the level of cyclin D1/CDK4 in the cells, which results in arresting in progression through the G1 phase to the S phase of the cell cycle. PA triggers pancreatic βcell cell apoptosis, possibly by reducing the levels of XIAP and cIAP2 in the cells.

　　KEY WORDS: pancreatic islets; saturated fatty acid; proliferation; apoptosis

　　在肥胖个体和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者中常有体内饱和游离脂肪酸(free fatty acid, FFA)的升高。研究发现，FFA的升高可能与胰岛β细胞功能障碍和凋亡密切相关。目前，关于FFA对胰岛β细胞凋亡的细胞分子机制尚不完全清楚，有待进一步研究。本实验以小鼠MIN6胰岛β细胞瘤株(以下简称MIN6细胞)为实验对象，观察饱和脂肪酸(棕榈酸，palmitate acid, PA)对体外培养下的MIN6细胞的增殖和凋亡的影响，以及探讨诱导胰岛β细胞凋亡，抑制细胞周期进程的可能细胞分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　MIN6β细胞株(16～30代)由加拿大McGill大学刘均利教授提供。DMEM培养基、胎牛血清(GIBICO)、AntibioticAntimycotic(100X)购自Invitrogen 公司;ECL高级 Western blot 检测试剂盒购自Amersham公司;抗小鼠AKT、磷酸化AKT、cyclin D1、CDK4多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;抗小鼠XIAP多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;抗小鼠cIAP2多克隆抗体购自美国Abcam 公司;辣根过氧化物酶结合二抗购自美国Jackson Immunolaboratories;AnnexinⅤ/FITC试剂盒购自美国罗氏公司;无FFA的牛血清白蛋白(BSA)及其余化学试剂均购自美国Sigma公司;仪器有酶标仪(Spectramax M2 Molecular Devices)、细胞流式仪(美国BD公司，型号：FACSCalibur)、Flurochem 8900图像采集仪(Alpha Innotech)。

　　1.2 游离脂肪酸的配制[1]

　　用0.1mol/L的NaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的PA，振荡混匀10min，然后过滤，配成100mmol/L的PA储存液。在55℃水浴中用去离子水配50g/L BSA溶液，过滤。然后，将上述的PA溶液和BSA溶液按1∶19的体积比混合配成5mmol/L PA/50g/L BSA复合液。复合液在水浴中振荡10s后继续水浴10min，取出后冷却至室温，过滤。然后将上述复合液分别用无血清的含葡萄糖25mmol/L的DMEM培养基以1∶5和1∶10的比例稀释成1.0mmol/L PA/10g/L BSA和0.5mmol/L PA/5g/L BSA的终浓度;用无血清的含葡萄糖25mmol/L的DMEM培养基以1∶10和1∶20的比例稀释成0.5mmol/L PA/5g/L BSA和0.25mmol/L PA/2.5g/L BSA的终浓度。

　　1.3 细胞培养

　　MIN6细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基(25mmol/L葡萄糖，10mmol/L的丙酮酸钠，10mmol/L的HEPES，2mmol/L的L谷氨酰胺，及55μmol/L的β巯基乙醇，10mL/L AntibioticAntimycotic在37℃/50mL/L CO2的细胞孵箱中培养，待到MIN6细胞(18～20代)80%左右贴壁，弃去原有培养基，用无血清的含5mL/L BSA和0.5mmol/L葡萄糖的DMEM培养基对细胞进行36h同步化培养。然后用无血清的25mmol/L葡萄糖DMEM培养基配制成不同浓度的PA和BSA进行干预，分组如下：①2.5g/L BSA;②5g/L BSA;③10g/L BSA;④0.25mmol/L PA/2.5g/L BSA;⑤0.5mmol/L PA/5g/L BSA;或⑥1mmol/L PA/10g/L BSA。

　　1.4 MMT法测定细胞增殖情况

　　将MIN6细胞按每孔5×103种于96孔培养板，待细胞80%贴壁，细胞同步化36h，弃去原有培养基，加入含不同浓度PA/BSA的培养基干预。实验组分别是终浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L的PA;同时分别设三组含2.5g/L BSA、5g/L BSA、10g/L BSA的对照组。每组10个复孔，每孔总反应体系为200μL。按照设定的时间6、16、24h在倒置显微镜下观察细胞并记录细胞形态;然后每孔加入MTT 10μL，继续培养4h。弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡10min，酶标仪测定550nm下各个组实验对象的吸光度。

　　1.5 对细胞周期的分析

　　将MIN6细胞按每孔5×104种于12孔培养板，待细胞80%贴壁，细胞同步化36h，弃去原有培养基，加入含不同浓度PA/BSA的培养基。每组设三个复孔。干预24h分别消化细胞，离心收集悬浮和贴壁细胞，用4℃ 预冷的PBS缓冲液洗细胞两遍后，然后用结合缓冲液重悬细胞，调节细胞的浓度为106/mL。每个样本取100μL的细胞悬液，加入10μL的碘化丙锭(PI，20mg/L)溶液和100mg/L RNA酶的结合缓冲液，混匀后置于37℃水浴箱30min，在每个样本中加入400μL结合缓冲液，上细胞流式仪测量细胞周期分布并分析。

　　1.6 用AnnexinⅤ/FITC试剂盒检测细胞凋亡

　　将MIN6细胞按每孔105种于6孔培养板，待细胞80%贴壁，同步化培养36h。实验组分别用含0.25mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L的PA的无血清(含葡萄糖25mmol/L)DMEM培养基培养，对照组用含2.5g/L BSA、5g/L BSA、10g/L BSA 的无血清(含葡萄糖25mmol/L)DMEM培养基培养。每组设三个复孔。在6、16、24h分别消化细胞，离心收集细胞，用4℃ 预冷的PBS缓冲液洗细胞两遍，然后用结合缓冲液重悬细胞，调节细胞的浓度为106/mL。每个样本取100μL的细胞悬液，加入5μL的AnnexinⅤ/FITC和10μL的碘化丙锭(PI，20mg/L)溶液，混匀后室温避光孵育15min，在每个样本中加入400μL结合缓冲液，采用流式细胞仪测量并分析。

　　1.7 蛋白的分析

　　将MIN6细胞按每孔106种于100mm有盖培养皿，待细胞80%贴壁，细胞同步化36h，弃去原有培养基，加入含不同浓度PA/BSA的培养基。每组设三个，按照设定的时间45min、6h、16h和24h，采用蛋白裂解液(150mmol/L NaCl，10mmol/L Tris, pH 7.4，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，100mL/L Triton X100，5mL/L Nonidet P40，100mmol/L NaF，10mmol/L焦磷酸钠，10mmol/L原钒酸钠，蛋白酶抑制剂)，在4℃提取细胞蛋白。用Brad法蛋白定量，50μg蛋白被130mL/L聚丙烯酰胺、1mL/L SDS胶分离，再转移到醋酸纤维素膜，转印膜用含50g/L脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，然后加入特异性一抗，4℃冷室中过夜。用TBST洗膜3次，每次10min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(用封闭液1∶5000稀释)，室温孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。用增敏化学发光底物试剂检测。使用Flurochem 8900采集图像，再用AlphaEase软件(Alpha Innotech)分析。

　　1.8 统计学处理

　　所有实验数据以±s表示。使用InStat 软件 version 3(美国，GraphPad Software)分析，采用单因素方差分析进行组间比较，两组比较采用成组设计资料 t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度的PA对MIN6细胞凋亡的影响

　　用不同浓度的PA作用，在各时间段均可见到凋亡细胞。随着时间的推移，各实验组的凋亡细胞量增多，尤其在24h后，倒置显微镜下可见到大量细胞凋亡：细胞皱缩成圆形或椭圆形，失去原有的突触，漂浮或悬浮于培养基中，不再贴壁生长。用AnnexinⅤ/FITC/PI双标记流式细胞术可测知不同浓度PA下，各个时间段各组细胞凋亡的比例。在6h，不同浓度的PA作用下细胞和对照相应浓度BSA组细胞的凋亡率无统计学差异(P>0.05)，在16h到24h，PA组的凋亡率则较对照组明显升高，0.25mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/LPA组在16h的细胞凋亡率分别是对照组的9.8倍(P<0.01)、18.9倍(P<0.01)和12.3倍(P<0.01);在24h的细胞凋亡率分别是对照组的8.5倍(P<0.01)、21.6倍(P<0.01)和8.3倍(P<0.01)，但以0.5mmol/L PA细胞凋亡与对照组相比明显多于其他组。0.25mmol/L、0.5mmol/L和1.0mmol/L PA作用16h和24h后，细胞凋亡率分别是作用6h的10.6、11.8、14.7倍和14.1、13.2、18.1倍(P<0.01)。对照组细胞的凋亡随着时间的推移逐渐增加，尤其是2.5g/L BSA、10g/L BSA 24h后引起细胞凋亡率分别是6h的4倍(P<0.01)和3.8倍(P<0.01)，而50g/L BSA在引起的细胞凋亡在各个时间段无统计学差异(P>0.05)(图1)。

　　2.2 不同浓度PA对MIN6细胞生长的影响

　　用不同浓度的PA分别作用细胞6、16、24h。与对照组相比，在各时间点， 0.5mmol/L、1.0mmol/L PA均能抑制细胞生长，且作用呈时间与剂量依赖性。其中0.5mmol/L PA在各时间段作用下的细胞生长程度仅为对照组的53%、48%和33%(P<0.01);1.0mmol/L PA在各时间段作用下的细胞生长程度仅为对照组的52%、33%和22%(P<0.01);而0.25mmol/L PA仅在16h点抑制细胞生长，为对照组的69%;其中以1.0mmol/L PA的抑制作用更为明显(P<0.01)(图2)。

　　2.3 不同浓度PA对MIN6细胞周期的影响

　　用0.5mmol/L、1.0mmol/L PA分别作用细胞24h。与对照组相比，0.5mmol/L、1.0mmol/L PA均可使细胞周期阻滞于G0/G1期，细胞比例分别显著上升至(70.2±4.5)%和(81.3±1.6)%;G2/M期与S期细胞比例降低，G2/M期细胞比例分别降至(16.0±3.5)% 和(11.5±2.6)%;S期细胞比例分别降至(13.8±1.5)% 和(7.2±1.2)%，其中1.0mmol/L PA作用更加明显(图3)。

　　2.4 Western blot测MIN6细胞生存相关蛋白pAKT/AKT

　　用0.5mmol/L PA分别作用细胞45min、6、16、24h，以5g/L BSA处理为对照组。Western blot方法测各实验组pAKT(ser473)和总AKT的表达。与对照组相比，随着时间推移，PA组pAKT蛋白表达量明显减少，pAKT/AKT的比值明显降低，6h，-47% (P<0.01);16h，-41%(P<0.01);24h，-60%(P<0.01)，而在45min点无统计学差异(P>0.05，图4)。

　　2.5 Western blot测MIN6细胞抗凋亡相关蛋白XIAP和cIAP2的表达

　　用0.5mmol/L PA 分别作用细胞45min、6、16、24h，以5g/L BSA处理MIN6细胞为对照组。Western blot方法测各实验组抗凋亡相关蛋白XIAP和cIAP2的表达。与对照组相比，随着时间推移，PA组XIAP蛋白表达量明显降低，XIAP/βactin 明显降低，45min，(76±6)%(P<0.05);6h，(83±9)%(P<0.05);16h，(64±4)%(P<0.05);24h，(38±7)% (P<0.05)(图5A)。同样发现：与对照组相比，随着时间推移，PA组cIAP2蛋白表达量明显降低，cIAP2/βactin 明显降低，6h，(56±9)%(P<0.05);16h，(45±6)%(P<0.05);24h，(17±7)%(P<0.05)，而在45min点无统计学差异(P>0.05，图5B)。

　　2.6 Western blot测MIN6细胞周期相关蛋白CDK4和cyclinD1的表达

　　用0.5mmol/L PA 分别作用细胞45min、6、16、24h，以5g/L BSA处理为对照组。Western blot方法测各实验组细胞周期相关蛋白CDK4和cyclinD1的表达。与对照组相比，随着时间推移，PA组CDK4蛋白表达量明显降低，CDK4/βactin 明显降低，6h ，(60±5)%(P<0.01);16h，(51±5)%(P<0.01);24h，(87±4)%(P<0.01)(图6A)，而在45min点无统计学差异(P>0.05)。同样发现：与对照组相比，随着时间推移，PA组cyclinD1蛋白表达量明显降低，cyclinD1/βactin 明显降低，45min，(54±7)%(P<0.01);6h，(60±5)%(P<0.01); 16h，(42±6)%(P<0.01)(图6B)，而在24h点无统计学差异(P>0.05)。

　　3 讨论

　　近年来，越来越多的研究显示：人体出生后胰岛β细胞的数量是由β细胞的自我分化、再生和β细胞的死亡(主要是由凋亡引起)这一动态平衡所决定。T2DM在血糖升高之前已存在胰岛β细胞功能的缺陷及凋亡。这种缺陷目前已普遍认为是与早期的脂代谢异常及后续的糖代谢异常密切相关。肥胖是T2DM发生的一个主要危险因素，过多的脂肪组织可使饱和FFA的释放增加，而血浆FFA水平的增高与胰岛素抵抗和T2DM的发生密切相关[2]。研究显示，适量的FFA对β细胞增殖与葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)来说是必须的[3]，在高糖环境下，FFA还可通过与细胞膜上的FFA受体1/GTP结合蛋白偶联受体40(GPR40)结合激活细胞内信号转导通路以及丙二酸单酰CoA/LCCoA途径，起到了放大GSIS的作用，以保证机体在营养过剩的状态下对胰岛素的需求[4];然而，长期高水平的饱和FFA则促进胰岛β细胞凋亡和引起细胞坏死，其中以诱导细胞凋亡为主，称为脂性凋亡，最终导致细胞数量减少，胰岛素分泌不足。当高糖和高脂同时出现时，两者可发生协同作用，加速β细胞的凋亡[2]。目前，关于脂性凋亡的机制还不清楚。

　　本实验所用的MIN6细胞能稳定表达GLUT2和葡萄糖激酶并保持对糖的反应性，与原代胰岛相似，是研究β细胞增殖和凋亡因素的理想模型[5]。本研究结果显示：PA可促进细胞凋亡，抑制细胞活力与增殖，且作用呈时间与剂量依赖性。在细胞周期调控中，G1～S期之间调控点是细胞内外信号传递、整合汇集到细胞核对细胞的增殖进行调控的关键点。PA可使细胞周期阻滞于G0/G1期，降低S和G2/M期细胞比例。提示PA抑制细胞的增殖是通过抑制G0/G1期向S期的转换，阻滞细胞周期进程，影响其复制。

　　研究证明：PA诱导的凋亡是通过神经酰胺线粒体凋亡途径。Caspase家族在细胞凋亡信号传导过程中起到核心作用，如caspase3在凋亡途径处于下游，是细胞凋亡的关键信号酶。内源性磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)/AKT信号通路是决定应激细胞生存的重要的信号转导通路之一，其下游反应元件很多，包括cIAP2和XIAP。cIAP2和XIAP属于IAP(抑制凋亡蛋白)家族，是caspase有效的抑制剂，IAP与BIR域结合直接抑制caspase，可阻断由caspase介导的细胞凋亡反应。XIAP与BIR2结合抑制凋亡蛋白酶caspase3、caspase7，激活caspase9，而对caspase1、caspase6、caspase8无效。cIAP2能够直接特异性结合凋亡蛋白酶caspase3、caspase7，抑制凋亡[6]。本研究结果证实：MIN6细胞在PA干预下，pAKT表达明显受抑，抑制了细胞在高脂环境下激活的PI3K/AKT信号通路，从而使阻断细胞凋亡的信号通路受抑制。同时PA能够降低IAP家族XIAP与cIAP2的表达，使细胞凋亡反应元件的抑制减弱，导致凋亡增加。

　　近年来，研究证明在小鼠出生后，胰岛β细胞的复制速率尽管较低，在维持胰岛β细胞的数目起着重要作用，并且在部分胰腺切除后，胰岛β细胞的复制亦起着关键作用[7]。细胞周期G1～S期之间调控点的异常与胰岛β细胞复制密切相关。与之相关的cyclinD1、CDK4和pRb(磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白)等共同组成一条重要的细胞周期调节通道。pRb磷酸化状态与细胞周期调控密切相关，低磷酸化时有活性，抑制细胞进入DNA合成期(S期);在cyclinD1/CDK4复合物的作用下发生磷酸化而失活;高磷酸化状态的pRb释放转录因子E2F，细胞即由G1期进入S期[8]。本研究结果证实：MIN6细胞在PA干预下，cyclinD1、CDK4表达明显受抑，cyclinD1抑制更早于CDK4，结合本研究细胞周期结果，提示PA可能通过抑制cyclinD1/CDK4复合物，抑制磷酸化pRb，从而抑制G0/G1期向S期的转换，阻滞细胞周期进程，影响其复制。

　　总之，本实验证实了饱和脂肪酸PA能够抑制MIN6细胞的生长和复制，并能显著促进其凋亡，显示出其对β细胞的细胞毒性作用。可能是通过降低cyclinD1和CDK4活性，使细胞滞留在G0/G1期，抑制细胞周期进程，影响其复制;同时降低抗凋亡蛋白XIAP和cIAP2活性，促使细胞的凋亡，导致胰岛β细胞数目减少从而发生糖尿病。

　　【参考文献】

　　[1]KARASKOV E, SCOTT C, VOLCHUK A, et al. Chronic palmitate but not oleate exposure induces endoplasmic reticulum stress which may contribute to INS1 pancreatic βcell apoptosis [J]. Endocrinology, 2006, 147(7):33983407.

　　[2]PRENTKI M, NOLAN CJ. Islet β cell failure in type 2 diabetes [J]. J Clin Invest, 2006, 116(7):18021812.

　　[3]NOLAN CJ, MADIRAJU MS, DELGHINGAROAUGUSTO V, et al. Fatty acid signaling in the betacell and insulin secretion [J]. Diabetes, 2006, 55 (Suppl 2):S1623.

　　[4]MURTHYMADIRAJU SR, POITOUT V. G Proteincoupled receptors and insulin secretion: 119 and counting [J]. Endocrinology, 2007, 148(6):25982600.

　　[5]HOHMEIER HE, NEWGARD CB. Cell lines derived from pancreatic islets [J]. Mol Cell Endocrinol, 2004, 228(12):121128.

　　[6]HU P, HAN Z, COUVILLON AD, et al. Critical role of endogenous Akt/IAPs and MEK1/ERK pathways in counteracting endoplasmic reticulum stressinduced cell death [J]. J Biol Chem, 2004, 279(47):4942049429.

　　[7]DOR Y, BROWN J, MARTINEZ OI, et al. Adult pancreatic βcells are formed by selfduplication rather than stemcell differentiation [J]. Nature, 2004, 429(6987):4146.

　　[8]COZARCASTELLANO I, TAKANE KK, BOTTINO R, et al. Induction of βcell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenoviral delivery of cyclindependent kinase4 and cyclin D1 [J]. Diabetes, 2004, 53(1):149159.