Jagged1蛋白在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达差异

　　作者：郭占鹏　 ,梅晰凡　 ,李全双　,王滢丽　 ,张赫　刘世琼　 作者单位：(1.辽宁医学院附属第一医院骨科;2.辽宁医学院附属第一医院内分泌科，辽宁 锦州 121000)

　　【摘要】 目的 Jagged1蛋白在大鼠肌源性干细胞(MDSCs)体外增殖分化为神经样细胞过程中的表达差异研究。方法 大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为2组：对照组完全培养基培养，诱导组加入诱导剂诱导。 6 d后观察2组细胞的形态变化,并进行NSE免疫细胞化学鉴定。然后通过免疫荧光观察Jagged1蛋白的表达差异。结果 诱导组细胞NSE染色阳性，免疫荧光结果显示对照组Jagged1蛋白表达阳性，实验组基本不表达。结论 大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Jagged1蛋白表达存在明显差异。

　　【关键词】 肌源性干细胞;神经样细胞;Jagged1蛋白

　　Expression Difference of Jagged1 Protein During the Differentiation of

　　Muscle Derived Stem Cells into Neuron-Like CellsGUO Zhanpeng1, MEI Xifan1, LI Quanshuang1, WANG Yingli2, ZHANG He1, LIU Shiqiong1

　　(1.Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;

　　2.Department of Internal Hormone, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000 China)Abstract: Objective To investigate the role of Jagged1 protein during the proliferation and differentiation of muscle derived stem cells (MDSCs) into neuron-like cells in vitro.Methods The skeletal muscle stem cells derived from the neonate rat were cultured and purified clonally in vitro. The 5 th passage cells were divided into the control group and the experimental group. Morphological change and immunocytochemical identification were observed six days after experiment intervention. Immunofluorescence was employed to examine the expression difference of Jagged1 protein. Results NSE positive cells were detected in the experimental group. Immunofluorescence showed that the levels of Jagged1 protein in the experimental group were much lower than that of the control group. Conclusions The levels of Jagged1 protein were decreased when the MDSCs differentiate into neuron-like cells in vitro.

　　Key words: muscle derived stem cells;neuron-like cells;Jagged1 protein

　　肌源性干细胞(muscle derived stem cells,MDSCs)具有良好的自我更新和增殖能力的干细胞，具多向分化潜能。它能够分化为神经样细胞,修复受损伤的神经,并可使受损的神经功能得到恢复[1]。近来一些研究表明Notch信号传导途径可能对肌源性干细胞干细胞增殖分化起非常重要的调控作用[2]。本实验选取Notch通路中的关键节点Jagged1蛋白的表达水平作为研究对象，为进一步研究肌源性干细胞分化为神经样细胞的机制打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂

　　SD大鼠乳鼠(辽宁医学院实验动物中心提供);Ⅱ型胶原酶(Sigma)，分散酶，胰蛋白酶(Sigma)，标准胎牛血清(四季青)，DMEM培养基(Gibco)，兔抗鼠Desmin、NSE、Jagged1蛋白抗体(武汉博士德)。

　　1.2 肌源性干细胞原代培养和鉴定

　　SD大鼠乳鼠无菌条件下取骨骼肌，采用混合酶(100 mL含有Ⅱ型胶原酶0.2 g，Ⅱ型分散酶0.48 g，CaCl2 0.028 g)消化1 h，筛网过滤，离心后含有15%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM重悬细胞，37 ℃ 、5%CO2培养;记为PP1，分别间隔2、16、24和24 h差速贴壁纯化细胞,记为PP2、 PP3、 PP4、PP5。PP5长满培养瓶底后， 0.25%胰蛋白酶消化传代培养。对传代细胞行Desmin免疫细胞荧光鉴定。

　　1.3 各组细胞培养和诱导前后表面抗体表达

　　传代后细胞培养离心重悬后，分为2组进行培养：1组：对照组，用完全培养基进行培养;2组：诱导组，以分化培养基(10%FBS,20μg/L NGF, 1%青链霉素，DMEM)进行培养培养。相差显微镜下观察细胞形态变化，培养6 d后行NSE免疫细胞化学鉴定和Jagged1蛋白免疫荧光表达检测。

　　1.4 免疫细胞化学检测

　　取生长有细胞的盖玻片，用4% 多聚甲醛固定15 min，3% BSA 封闭30 min，加入一抗，阴性对照用PBS 代替一抗，4 ℃过夜。避光进行以下操作：加入二抗，37 ℃孵育30 min，30 μL/mL 33258染色 8 min，甘油封片，荧光显微镜下观察结果。

　　1.5 免疫细胞荧光检测

　　将消毒完的盖玻片放到培养皿中，加入细胞悬液，5%CO2孵箱培养2～3 d，4%多聚甲醛固定30 min;0.3%Triton-100作用5 min，PBS洗2 次，3%H2O2作用20～30 min;加封闭液20 min，甩去多余液体，不洗，一抗4 ℃过夜;二抗1：100作用2 h;SABC 30 min;DAB试剂盒作用30 min;苏木素染色0.5 min;梯度酒精脱水(75%-85%-95%-100%)，每次4 min。二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min。缓冲甘油封片，无荧光指甲油封4 周。

　　2 结 果

　　2.1 传代后细胞形态

　　传代培养的MDSCs呈不规则形;随培养时间延长及传代次数的增加,细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列，极易融合，生长呈方向性(图1)。

　　2.2 MDSCs传代后Desmin免疫荧光鉴定

　　采用Desmin一抗对MDSCs进行鉴定,细胞质Desmin染色为阳性细胞。观察500个细胞,阳性率达到90%(图2)。

　　2.3 诱导后细胞形态观察

　　经诱导6 d后，细胞生长状态良好，出现长突起，类似神经细胞，细胞突起之间似发生联系，变化呈渐进性，分化率较高，此时细胞无明显增殖现象，未见神经球形成(图3)。

　　2.4 诱导分化后的细胞NSE(神经元特异性烯醇化酶)表达

　　诱导6 d后神经样细胞的胞体和突起NSE染色呈强阳性，而未分化的细胞为阴性(图4)。

　　2.5 诱导分化后的细胞Jagged1 蛋白表达

　　诱导6 d后神经样细胞的胞体和突起Jagged1 蛋白表达阳性，而未分化的细胞基本不表达(图5、6)。

　　3 讨 论

　　传统观点认为中枢神经系统损伤后，由于内在的再生能力差和外在的微环境的抑制，损伤轴突不能再生。然而近年的基础研究发现脊髓损伤后采用组织工程方法，将有活性的种子细胞移植治疗脊髓损伤，能促进损伤轴突修复、再生和恢复脊髓部分神经功能[3]。

　　MDSCs是不同于卫星细胞的一类成体干细胞，后者只有单一分化潜能,而且MDSCs具有长时间强大的自我更新能力,在特定刺激下，可在体外分化为神经细胞、骨细胞、平滑肌细胞[4]等系的细胞，且来源丰富，可离体分离、培养和扩增，移植后细胞存活率显著高于卫星细胞，有较好的同种异体免疫反应调节能力，为自体干细胞治疗遗传缺陷性或退行性疾病及组织器官损伤的修复提供理想的种子细胞。

　　Notch基因是发现于果蝇体内的一种特定的突变形式,这种突变可以影响果蝇翅、眼、刚毛的形成。1940年发现这个基因在果蝇属胚胎细胞发育时可以发生基因突变，而它的缺失会导致神经系统的过度分化[5]。1985年通过分子克隆技术证实果蝇中Notch基因编码一种膜蛋白受体，邻近细胞上的Delta配体也是一种膜蛋白[6]。在哺乳动物体内，存在4个Notch受体(Notch1-Notch4)和五个结构类似的Notch配体(Delta-likel，Delta-like3，Delta-like4，Jaggedl和Jagged2)[7]。

　　Jagged1是存在于哺乳动物细胞膜上Notch受体的主要配体之一，为单次跨膜糖蛋白，表达于骨髓、胎儿肝基质细胞和胸腺上皮细胞等多种组织，参与调控许多组织的生长发育。Jaggedl在造血、肌肉形成、神经和血管发生等过程中起重要作用。可溶型非跨膜的Jaggedl在血管瘤形成中能够影响成纤维细胞的[8]。Jaggedl的突变可以导致一种常染色体显性遗传的多脏器发育异常性疾病，即Alagilie综合征。

　　本文通过在研究中我们注意到，在肌源性干细胞诱导分化为神经样细胞的过程中，Jagged1蛋白的表达显著下降。这说明在体外诱导分化过程中，Jagged1蛋白发挥了重要作用，其具体作用机制尚待进一步研究证明。

　　【参考文献】

　　[1] Kang SB, Lee HN, Lee JY, et al. Sphincter contractility after muscle-derived stem cells autograft into the cryoinjured anal sphincters of rats[J]. Dis Colon Rectum，2008,51(9):1367-1373.

　　[2] Matsumoto T, Cooper GM, Gharaibeh B,et al. Cartilage repair in a rat model of osteoarthritis through intraarticular transplantation of muscle-derived stem cells expressing bone morphogenetic protein 4 and soluble Flt-1[J]. Arthritis Rheum，2009 ,60(5):1390-1405.

　　[3] Tetsuro Tamaki,Yoshinori Okada,Yoshiyasu Uchiyama，et al. Synchronized reconstitution of muscle Wbers, peripheral nerves and blood vessels by murine skeletal muscle-derived CD34-/45-cells[J]. Histochem Cell Biol ，2007,128:349–360.

　　[4] Poulson DF. The effects of certain X-chromosome deficiencies on the embryonic development of Drosophila melanogaster[J]. J Exp Zool,1940,83:271–325.

　　[5] Buas MF, Kabak S, Kadesch T. Inhibition of myogenesis by Notch: evidence for multiple pathways[J]. J Cell Physiol,2009,218(1):84-93.

　　[6] Liu T, Hu B, Choi YY，et al.Notch1 signaling in FIZZ1 induction of myofibroblast differentiation [J]. Am J Pathol,2009,174(5):1745-1755.

　　[7] Sun D, Li H, Zolkiewska A. The role of Delta-like 1 shedding in muscle cell self-renewal and differentiation[J]. J Cell Sci,2008,121(22):3815-3823.

　　[8] Holterman CE, Le Grand F, Kuang S，et al.Megf10 regulates the progression of the satellite cell myogenic program [J]. J Cell Biol, 2007,179(5):911-922.