罗格列酮对RIN-m细胞高糖损害干预作用研究

　　作者：胡文 作者单位：徐州医学院附属淮安医院内分泌科,江苏淮安223002

　　【摘要】 研究罗格列酮(rosiglitazone,RSG)对胰岛β细胞高糖损害的干预作用。方法 采用生理浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)、生理浓度葡萄糖+罗格列酮、高浓度葡萄糖(33.3 mmol/L)、高浓度葡萄糖+罗格列酮培养RIN-m细胞。以放射免疫法检测胰岛素分泌水平。以流式细胞仪及TUNEL法检测RIN-m细胞凋亡。RT-PCR方法检测胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox factor-1，PDX-1)和胰岛素mRNA表达。结果 ①RIN-m细胞与33.3 mmol/L的葡萄糖孵育2周后胰岛素分泌功能开始下降，细胞凋亡率增长2.7倍(P<0.01)。而罗格列酮可以修复胰岛素的分泌，降低RIN-m细胞凋亡率。②罗格列酮上调 PDX-1(1.30±0.06 vs. 1.61±0.10，P<0.01)和胰岛素 (1.75±0.09 vs. 1.98±0.11，P<0.01) mRNA表达。结论 高糖抑制胰岛β细胞胰岛素分泌，并诱导其凋亡。罗格列酮具有直接保护β细胞免于高糖毒性的作用。

　　【关键词】 罗格列酮 RIN-m细胞 凋亡 胰腺十二指肠同源盒-1

　　The effect of rosiglitazone on high glucose-induced RIN-m cells impairment

　　HU Wen1， YU Weinan1*， LI Wei2

　　(1. Department of Endocrinology, Affiliated Huai′an Hospital of Xuzhou Medicl College，

　　Huai′an， Jiangsu 223001， China;2. Department of Endocrinology, Affiliated Hospital of Xuzhou

　　Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of rosiglitazone (R) on high glucose-induced RIN-m cell impairment. Methods The RIN-m cells were cultured in media containing normal glucose (5.5 mmol/L, NG), NG+R 50 μmol/L (NG+R), high glucose (33.3 mmol/L, HG) and HG+R 50 μmol/L (HG+R). Insulin secretion was measured by radioimmunoassay. Apoptosis of RIN-m cells were determined by in situ TUNEL method combined with flow cytometry. The mRNA expression of pancreatic duodenal homeobox factor-1 (PDX-1) and insulin was measured by semi-quantitative RT-PCR assay. Results (1) After 2 weeks of incubation, the presence of high glucose increased the apoptosis of RIN-m cells to 2.7 folds and decreased the insulin secretion (P<0.05) . The addition of R inhibited the high glucose-induced increase of apoptosis of RIN-m cells and improved the insulin secretion (P<0.05). (2) Incubation of RIN-m cells with high glucose plus R for 2 weeks, increased the mRNA expression of PDX-1 [from(1.30±0.06 ) to (1.63±0.10)，P<0.05] and that of insulin [from (1.75±0.09) to ( 1.98±0.11), P<0.05]. Conclusions High glucose can induce cell apoptosis and decrease insulin secretion. R (rosiglitazone) has direct protective effects on β cells against the glucotoxicity.

　　Key words: rosiglitazone; RIN-m cell; apoptosis; pancreatic duodenal homeobox factor-1(PDX-1)

　　持续高糖环境导致胰岛功能缺陷和胰岛数量的减少[1]，最终胰岛β细胞功能衰竭。如何在降糖的同时延缓胰岛β细胞功能减退，已成为临床上影响糖尿病病程进展的关键，也是影响病程进展和预后的主要因素。目前以β细胞作为干预靶点来治疗糖尿病的药物很少。然而近来多项动物实验及多中心临床研究[2-3]显示噻唑烷二酮类药物可以延缓胰岛β细胞功能衰竭，但这种作用是源于改善了代谢紊乱还是对β细胞有直接保护作用，并不完全清楚。本研究以体外培养的β细胞系RIN-m细胞为对象，研究噻唑烷二酮类药物罗格列酮对胰岛β细胞高糖损害的早期干预作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞 RIN-m细胞购自北京百星高科技术货物进出口公司(来源于ATCC)，系射线诱导的大鼠胰岛细胞瘤。

　　1.1.2 试剂 罗格列酮纯品粉末由四川太极集团提供。无糖型RPMI 1640购自Hyclone公司。胎牛血清购自加拿大PAA公司。大鼠胰岛素放免测定试剂盒购自北京科美东雅公司。RT-PCR试剂盒和TUNEL细胞原位凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司。Annix-Ⅴ检测试剂盒购自Biovision公司。PCR引物由上海生工合成。

　　1.1.3 仪器 MJ PTC-200 PCR 仪(MJ Research Inc，USA)，凝胶成像系统(上海复日科技公司)，LEICA Qwin 图像分析和处理系统(德国)，流式细胞仪(美国BD公司FACSCalibur)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养与分组 RIN-m细胞在无糖型RPMI 1640中常规培养，以约5×107/L接种培养皿中，每2天换液1次，体外培养。实验分4组，每组重复5次：①生理浓度葡萄糖(NG)组，培养液含5.5 mmol/L葡萄糖;②NG+罗格列酮(NG+R)组，培养液含5.5 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L 罗格列酮;③高浓度葡萄糖(HG)组，培养液含33.3 mmol/L葡萄糖;④HG+罗格列酮(HG+R)组，培养液含33.3 mmol/L葡萄糖+50 μmol/L罗格列酮。

　　1.2.2 胰岛分泌功能检测 ① 收集不同时间点(表1)106细胞培养液-20℃保存。实验结束时采用竞争放射免疫的方法检测胰岛素(INS)水平。② RT-PCR半定量测定RIN-m细胞胰岛素和胰腺十二指肠同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox factor-1，PDX-1)mRNA水平。胰岛素(187 bp,大鼠)：上游引物5′-TGCCCA GGCTTTT GTCAAA CAGCA CCT T-3′, 下游引物5′-CTCCAGTGCCAA GGTC TGA-3′。β-actin(542 bp):上游引物5′-CTCTTTGATGTCACGCACGA TTC-3′，下游引物5′-ATC GTGGG CCGCTC TAGG C ACC-3′，扩增片段长度为542 bp。胰岛素和β-actin反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，32个循环，72℃终末延伸7 min。PDX-1(364 bp，大鼠)：上游引物5′-ACATC TCCCCA TAC GAAGTGCC-3′，下游引物5′-AAGTGAGCATCACTGCC AG CTCC-3′。PDX-1反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性60 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s。共30个循环，72℃终末延伸10 min。取各组不同时间点的RNA 2 μl加入oligdT(12-18)及AMV逆转录酶进行反转录成cDNA,然后进行PCR反应。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳观察，Smartview 2001图像分析处理系统采集图象，扫描制片，结果使用Quantity One分析软件分析条带的吸光面积，以目的基因与β-actin吸光面积积分比值计算。

　　1.2.3 细胞凋亡检测

　　1.2.3.1 形态学观察 倒置显微镜下观察RIN-m细胞在培养过程中形态变化。

　　1.2.3.2 流式细胞仪分析凋亡 采用Annexin-Ⅴ检测试剂盒分析早期凋亡率。

　　1.2.3.3 TUNEL法检测凋亡率 将生长于24孔板中不同条件下培养的大鼠RIN-m细胞用4%的新鲜配置的多聚甲醛固定后,应用TUNEL细胞原位凋亡检测(生物素标记)试剂盒检测细胞凋亡情况。操作按试剂盒说明，DAB显色凋亡阳性细胞后,再用苏木素复染阴性细胞核。每份样品随机选取高倍镜视野,分析计数100个细胞,计算细胞凋亡百分率。

　　1.3 统计学处理 整个实验采用完全随机分组、随机对照研究方法。数据以±s表示，用SPSS统计软件处理。组间比较采用单因素方差分析，再行scheffe法两两比较。P<0.01认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 胰岛分泌功能检测

　　2.1.1 胰岛素水平检测 见表1。HG组和HG+R组胰岛素释放水平先升高后逐渐下降， HG+R组下降幅度较HG组小(P<0.01)，而NG组和NG+R组缓慢下降，无统计学差异(P>0.05)。各时间点HG+R组胰岛素分泌水平显著高于HG组(P<0.01),而NG+R组与NG组无显著变化(P>0.01)。 表1 罗格列酮对高糖诱导胰岛素释放影响 与NG组比较：*P<0.01;与NG+R组比较：#P<0.01;与HG组比较：△P<0.01

　　2.1.2 罗格列酮对PDX-1和胰岛素mRNA影响 见表2，图1、2。PDX-1和胰岛素mRNA二者不同时间点各组变化趋势一致。随时间的延长，NG组和NG+R组PDX-1和胰岛素mRNA无显著变化。HG组和HG+R组PDX-1和胰岛素mRNA表达先增强，后下降。HG组下降幅度大，HG+R组下降幅度小，两者有统计学差异(P<0.01)。表2 罗格列酮对高糖诱导的RIN-m细胞PDX-1和胰岛素mRNA表达的影响 第1周，HG+R组与HG组PDX-1和胰岛素mRNA表达无明显差异，但显著高于NG和NG+R组(P<0.01)。 第2周，HG组PDX-1和胰岛素mRNA表达明显下降。HG+R组显著高于HG组(P<0.01)。

　　2.2 RIN-m细胞凋亡变化

　　2.2.1 形态学观察 正常RIN-m细胞呈多边不规则形，细胞之间有连接融合倾向，胞质内含有分泌颗粒。培养过程中，各组形态大体无变化。但HG组细胞较NG组传代后贴壁能力下降，生长缓慢，并时有细胞漂浮脱壁(图3)。HG+R组较HG组状态有改善。

　　2.2.2 流式细胞仪检测凋亡(annexin-Ⅴ法) NG组、NG+R组、HG组、HG+R组早期凋亡率分别为(6.3±1.8)% 、(7.61±2.7)% 、(17.2±3.5)%、(10.2±3.6)%，多组比较有显著差异(P<0.01)。两两比较，HG组早期凋亡率显著高于NG组(P<0.01)，罗格列酮可以降低RIN-m细胞早期凋亡率(P<0.01)(图4)，且这种作用是葡萄糖依赖的。图3 倒置显微镜观察RIN-m细胞(2周)(×400)

　　A：NG组 B：HG组图4 罗格列酮对RIN-m细胞凋亡的影响 (流式细胞仪,annexin-Ⅴ法)

　　A：NG组 B：NG+R组 C：HG组 D：HG+R组

　　2.2.3 TUNEL法检测凋亡 见图5，表3。凋亡的RIN-m细胞胞核呈棕褐色(凋亡染色阳性),未发生凋亡的胰岛RIN-m细胞胞核呈蓝色(苏木素染色)。高糖刺激早期，RIN-m细胞凋亡率无明显变化。高糖持续刺激2周后, RIN-m细胞凋亡率增加，而罗格列酮可抑制RIN-m细胞凋亡(P<0.01)。图5 RIN-m细胞凋亡(TUNEL染色，×200)与NG组比较：*P<0.01;与NG+R组比较：#P<0.01;与HG组比较：△P<0.01

　　3 讨 论

　　继发于胰岛素绝对或相对不足所致的高血糖是糖尿病患者最典型的临床特征。目前国际上已有的研究[4-5]表明，高血糖对胰岛β细胞的损害主要表现在：①加重胰岛素的分泌缺陷和胰岛素抵抗;②诱导胰岛β细胞发生凋亡。噻唑烷二酮类药物通过作用于胰岛素主要靶组织肝脏、脂肪、肌肉组织中一种过氧化物酶体增殖物激活受体γ，参与代谢所需要的多种功能物质的基因转录调控，从而改善胰岛素抵抗。近来有研究[6]表明β细胞膜有中等量的过氧化物酶体增殖激活受体γ表达，支持噻唑烷二酮类药物可以直接作用于β细胞。本研究显示，长期高血糖诱导RIN-m细胞凋亡，抑制胰岛素的分泌，而罗格列酮早期干预可以抑制高糖诱导的β细胞凋亡，促进胰岛素的分泌，提示罗格列酮有独立于改善代谢以外的对β细胞的直接保护作用。

　　近来有研究表明，高糖刺激β细胞诱发氧化应激，而过度氧化应激激活JNK-c-fos/c-jun信号途径，抑制了胰岛素转录因子PDX-1蛋白的核内转位[7]，抑制了胰岛素的基因表达[8]，导致胰岛素生物合成减少。而PDX-1不仅是一种重要的调节胰腺发育胰岛细胞分化的核因子[9]，而且还通过调节多种基因如胰岛素、GLU-2、葡萄糖激酶的表达，维持正常胰岛素的合成与分泌。本研究则显示长期高糖还可以抑制β细胞PDX-1 mRNA的表达，减少胰岛素合成。本组结果显示：随时间的延长，各组胰岛素水平、PDX-1和胰岛素mRNA表达均呈现下降趋势，而HG+R组下降幅度显著低于HG组。且不同时间点HG+R组PDX-1和胰岛素mRNA表达水平显著高于HG组，而NG+R组与NG组无显著差异。因此我们认为罗格列酮对高糖环境β细胞胰岛素分泌具有直接的保护作用，这种保护作用可能是通过促进 PDX-1及胰岛素基因转录，促进胰岛素合成实现的，且这种保护作用是葡萄糖依赖的。至于罗格列酮调节PDX-1及胰岛素基因转录机制不明。可能的解释是噻唑烷二酮类药物抑制氧化应激[10]及抑制了c-fos/ c-jun 转录活性[11]，进而促进PDX-1向核内转移，与胰岛素基因结合，促进其转录，最终胰岛素合成增加。但目前也有研究[12]认为，在PDX-1 mRNA上游有过氧化物酶体增殖激活受体γ反应元件，罗格列酮可以直接调控PDX-1 mRNA的表达，进而促进胰岛素合成增加。

　　已有对不同人群胰岛β细胞数量进行系统的研究[13]显示，β细胞的复制和再生水平在不同人群没有差别，而在糖尿病患者中，肥胖和消瘦的患者与各自对照组比较，β细胞凋亡率分别增长了3倍和10倍。作为人胰岛β细胞主要来源的新胰岛的形成在2型糖尿病中与正常人群相比没有改变，提示β细胞凋亡的增加是导致糖尿病患者β细胞数量减少的主要机制。既往研究表明高糖可以抑制PDX-1的表达，使胰岛β细胞对凋亡因子的敏感性增强，细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的减少，最终使胰岛β细胞的凋亡数增多[14]。在高糖刺激早期，PDX-1表达升高，RIN-m细胞凋亡率无明显变化;1周后PDX-1快速下降, RIN-m细胞凋亡率增加;罗格列酮延缓了PDX-1的快速下降，抑制RIN-m细胞凋亡。本研究中PDX-1与凋亡率的反向变化提示了二者之间的内在联系，提示罗格列酮可能通过上调PDX-1 mRNA的表达,降低胰岛β细胞对凋亡因子的敏感性，进而抑制β细胞凋亡。

　　总之，高糖对β细胞功能的损害是多方面的，而罗格列酮对β细胞功能的保护也是多方面的。本研究从一个角度证实了罗格列酮具有直接保护β细胞免于高糖损害的作用。PDX-1表达增加在罗格列酮对β细胞功能保护过程中发挥了重要的作用，为临床上维持β细胞功能提供了新方法和新靶点。

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